[發明專利]一種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關基因cDNA全長的方法

無效

• 申請號: 201310731988.4
• 申請日: 2013-12-27
• 公開（公告）號: CN103710358A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 房衛平;趙付安;謝德意;李武;楊曉杰;趙元明;呂淑平;唐中杰;聶利紅
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院經濟作物研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于棉花抗病基因克隆領域，尤其涉及一種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關基因cDNA全長的方法。

背景技術

NBS-LRR(Nucleotide-binding?site，Leucine-rich?repeat)類抗病蛋白通過與病菌效應因子結合，其氨基端和LRR結構域發生構象變化，從而使NBS功能域發揮激酶作用，進而由氨基端的TIR(Toll?and?human?interleukin?receptor)或CC(coiled-coil)功能域激活下游信號傳導，最終在感染部位的細胞和組織局部發生壞死的過敏反應(Hypersensitive?response)(Jones?et?al，2006)，抵御病原菌的侵染，并避免病原菌進一步擴散。

迄今為止，大約70多個R基因已被克隆并鑒定(Liu?etal.，2007)。我國對R(resistance)基因的定位和克隆方面也取得了較大的進展(陳捷胤，2010；張立榮等，2011)。目前，國內外研究主要集中在TIR-NBS-LRR類抗病蛋白各功能域的功能(Traut，1994；Hulbert?et?al.，2001；Mestre?et?al.，2006)、抗病蛋白編碼基因之間的互作、及抗病蛋白與上下游信號分子的識別等方面(Zhang?et?al.，2010)。LRR結構域負責首先與無毒蛋白的識別(Jones?et?al.，1997)，并決定特異抗性(Hulbert?et?al.，2001)。TIR結構域在啟動下游防御信號途徑中起主要作用(Shirasu?et?al.，2003)，且該結構域多在雙子葉植物中存在(Meyers?et?al.，2003)，而單子葉植物中很少見(Monosi?et?al.，2004)。該特點可能與雙子葉植物的特異抗性有關。NBS結構域存在于真核生物的許多蛋白中，這些蛋白對于細胞的生長、分化、細胞骨架的形成、小泡運輸和防御反應都有關鍵性的作用(Pan?et?al.，2000；Dangl?et?al.，2001)。該特征暗示NBS結構域的功能十分廣泛。

有研究指出，NBS-LRR類基因在植物基因組中呈多拷貝、且往往成簇存在(Meyers?et?al.，2002)，這或許是植物產生應對不同病原物或同種病原物的不同小種特異抗性的遺傳基礎(Meyers?et?al.，2003)。有報道表明，眾多的NBS-LRR類基因在擬南芥各呈現低水平表達、并且其中一部分成組織特異性表達模式。在病原菌誘導下，也只是為數不多的幾個NBS-LRR類基因呈現表達水平的改變，而剩余的絕大多數基因的表達水平并無變化(Tan?et?al.，2007)。以上報道暗示，植物在某一病原物浸染下，不是一個NBS-LRR類基因，更不是其全部NBS-LRR類基因在起作用，而是針對該病原物的特定效應因子，植物中自身有選擇的幾個NBS-LRR類基因在協同發揮作用，進而誘導超敏反應。

必須承認植物與病原菌相互作用機制的復雜性。植物中存在的眾多NBS-LRR類基因是以什么樣的方式在起作用的，植物抗病信號轉導途徑中NBS-LRR類蛋白的上下游因子又是如何將抗病信號一步一步轉導下去的，而病原菌釋放的效應因子(effector)又具有什么樣的特性和共性。這些問題的解答需要植物病理學、微生物學等眾多領域共同的努力，并且預期需要一個很漫長的過程。

最近，有研究指出植物實現自身的抗病功能需要成對的NBS-LRR類抗病蛋白的同源或異源互作。多種多樣的NBS-LRR基因對在植物抗多種病原菌中協同起作用Sinapidou?et?al.，2004；Narusaka?et?al.，2009；Birker?et?al.，2009)。

目前的研究結果亦表明，黃萎病菌W株系誘導瑟伯氏棉，4個NBS-LRR類抗病蛋白點(雙向電泳差異點)集中高調表達(Zhao?et?al.，2012)。

發明內容

本發明實施例的目的在于提供一種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關基因cDNA全長的方法，旨在解決現在獲取野生棉抗病基因方法缺乏的問題。

本發明實施例是這樣實現的，一種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關基因cDNA全長的方法，該方法包括以下步驟：

培育瑟伯氏棉幼苗，制備黃萎病菌孢子懸液；

培養缽中接菌誘導，取瑟伯氏棉幼根，提取RNA，合成cDNA第一鏈；

利用瑟伯氏棉近緣物種雷蒙地棉PGIP等基因的EST序列，進行序列延伸，設計特異引物完成電子克隆；