[發明專利]一種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關基因cDNA全長的方法

無效

• 申請號: 201310731988.4
• 申請日: 2013-12-27
• 公開（公告）號: CN103710358A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 房衛平;趙付安;謝德意;李武;楊曉杰;趙元明;呂淑平;唐中杰;聶利紅
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院經濟作物研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種獲得瑟伯氏棉五個抗病相關基因cDNA全長的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

培育瑟伯氏棉幼苗，制備黃萎病菌孢子懸液；

培養缽中接菌誘導，取瑟伯氏棉幼根，提取RNA，合成cDNA第一鏈；

利用瑟伯氏棉近緣物種雷蒙地棉PGIP基因的EST序列，進行序列延伸，設計特異引物完成電子克隆；

瑟伯氏棉PGIP基因EST的PCR擴增、回收，連接在pGEM-T?Easy?Vector上，將PGIP基因片段轉化到感受態細胞DH5α；

RACE法克隆cDNA全長，基因組DNA的PCR擴增及回收，純化目的片段；

PGIP基因的Real?Time?PCR，序列分析。

2.如權利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關基因cDNA全長的方法，其特征在于，培育瑟伯氏棉幼苗的步驟為：

種子表面用1‰升汞消毒液處理8min，無菌水充分沖洗后，播種于事先高壓滅菌，建筑細沙：蛭石＝6：4的無底紙缽內的培養土中，于人工可控溫室晝溫28℃，夜溫25℃，相對濕度60％發芽，待幼苗第二片真葉展開時接菌，每缽保留3-5株發育一致的幼苗備用。

3.如權利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關基因cDNA全長的方法，其特征在于，制備黃萎病菌孢子懸液的步驟為：

黃萎病大麗輪枝菌平板活化后，轉接到培養基，200rpm，25℃液體培養10天，經4層滅菌紗布過濾，無菌水稀釋，制成1.2×10⁷孢子/ml的孢子懸液。

4.如權利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關基因cDNA全長的方法，其特征在于，接菌誘導的條件為：室內控制晝溫25℃，夜溫22℃，相對濕度80％。

5.如權利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關基因cDNA全長的方法，其特征在于，瑟伯氏棉PGIP基因cDNA電子克隆的具體步驟為：

采用雙向電泳差異蛋白的同源蛋白Q93WN4，在NCBI上搜索瑟伯氏棉近緣物種雷蒙地棉PGIP基因的EST序列，利用ClasX進行序列延伸，以此序列設計特異引物：

F??5′-ACAAAGCAATGAAGCCAGTC-3′

L??5′-GATCAACAAGCTCGAAGTGG-3′

以瑟伯氏棉cDNA為底物擴增瑟伯氏棉EST。

6.如權利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關基因cDNA全長的方法，其特征在于，PGIP基因cDNA的PCR擴增的方法為：

選取瑟伯氏棉20h第一鏈cDNA，根據電子克隆結果設計特異引物進行PCR，每管體系為：HS酶mix25μl，5端引物2μl，3端引物2μl，cDNA3μl，超純水18μl，采用Touchdown程序：95℃1min*6cycles，72℃10min。

7.如權利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關基因cDNA全長的方法，其特征在于，RACE法克隆cDNA全長的方法為：

選取接菌20h根的總RNA，反轉第一鏈cDNA，以此為模板，以瑟伯棉PGIP基因EST序列設計引物GPS1，GPS2，擴增瑟伯氏棉PGIP基因的3′端和5″端；

①′端和3′端的PCR擴增及回收測序：

引物：GPS1??CGTGGAGAGCTGCTTTGAATGCTAACAG

??????GPS2??GAGTCGAAACGGGTTAGCGGGTAA

UPM：

LONG

5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′

SHORT5′-CTAATAACGACTCACTATAGGGC-3′

擴增產物經1.2％TAE瓊脂糖凝膠電泳后，分別回收5′端和3′端片段；

拼接cDNA全長，并據此設計一對跨中間EST片段的引物FL-F/FL-R，以3′-reace-ready?cDNA擴增進行全長序列驗證，擴增全長的PCR引物：

FL-F??5′-AAAAACATCCTTCCTCC-3′

FL-R??5′-TTACTGACATTATTAACGAC-3′。

8.如權利要求1所述的獲得瑟伯氏棉五個抗病相關基因cDNA全長的方法，其特征在于，獲得四個NBS-LRR類抗病基因cDNA的方法為：

根據黃萎病菌誘導下瑟伯氏棉差異表達蛋白的三個同源蛋白：①煙草的B3V7R2蛋白，②棉白楊的B9INW6蛋白，③擬南芥的Q19EF1蛋白，在NCBI找到最高e-velue的雷蒙地棉的對應EST，分別設計引物，在接菌瑟伯氏棉根中擴增到520bp、788bp、643bp和729bp四條EST序列，以此為母序列，通過電子克隆和RACE結合，得到了四個TIR-NBS-LRR類抗病基因類似物。