[發明專利]一種使用固相和液相組合技術制備利西拉來的方法

在審

• 申請號: 201310731786.X
• 申請日: 2013-12-27
• 公開（公告）號: CN103819553A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 蘇賢斌;林山;俞侖
• 申請（專利權）人: 蘇賢斌
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C07K1/06;C07K1/04;C07K1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及多肽藥物合成技術領域，具體涉及一種固相和液相組合技術制備利西拉來的方法。

背景技術

利西拉來(Lixisenatide，商品名Lyxumia，氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示)是由Zealand?Pharma與Sanofi-Aventis公司合作開發的一種1日給藥1次的II型糖尿病治療藥物，其結構是基于具有降糖活性的GLP-1類似物Exendin-4的氨基酸序列，去掉其38位的脯氨酸并在C端加上6個賴氨酸而得到的一種新型GLP-1類似物，能耐受體內二肽基肽酶IV(DPP4)的降解作用。體外研究表明，Lixisenatide與GLP-1受體的親和力大于內源性GLP-1。II型糖尿病模型實驗顯示，本品可有效改善血糖水平，且對胰腺β細胞具有潛在保護作用。目前該藥物在歐盟的上市申請已獲得歐洲藥品管理局(EMEA)的批準。

在目前市售的GLP-1受體激動劑類抗糖尿病藥物中，只有諾和諾德公司(Novo?Nordisk)開發的Victoza(利拉魯肽)為每天給藥1次的產品。據Jefferies分析員預估，到2018年底，每天僅需給藥1次的GLP-1受體激動劑的全球銷售量將達到25億美元，Lyxumia極有希望獲得6.5億美元的全球銷售額或搶占GLP-1受體激動劑類藥物市場份額的15％。

利西拉來可通過基因重組方法來制備，但基因重組方法存在制備技術復雜、成本高昂、非特異結構多、難以純化等缺點，不適用于工業化生產。中國發明專利CA102558338A公布了一種常規的全固相合成方法來制備利西拉來。全固相合成操作簡單，對于一些片段較短的肽鏈是一個快捷高效的方法。然而，隨著肽鏈的延長，其中疏水性強的肽段形成β-折疊的可能性很大，固相合成方法往往導致出現困難序列。此外，固相肽合成中還存在肽鏈與樹脂載體之間的分子集聚(aggregation)現象，這都會造成偶聯和脫保護效率大大降低。很顯然，對于含有44個氨基酸的利西拉來來說，這一合成途徑需要重復幾十步偶聯和脫保護步驟，合成路線冗長，操作工藝繁瑣；且隨著肽鏈的延長和可能存在的二級結構的影響，縮合效率越來越差，導致雜質變多且難以分離，目標產物收率極低，成本很高，不適合工業化生產。

使用固相和液相結合的片段縮合技術，適合于合成含有較長氨基酸序列的多肽，其優點在于副產物較少且易于純化，產物純度高。然而，片段縮合策略有時會受阻于(i)有增加消旋的危險；(ii)大的保護片段溶解度差；(iii)片段間的低縮合率并伴有副反應發生的危險。為了消除或減少消旋，一般選擇Gly或Pro作為片段的C端殘基，如果不能實現這一點，則選擇Ala或Arg作為C端殘基，因為它們不易消旋。在應用片段縮合策略時，對目標序列進行合理的分段可以大大改善結果。除了合理選擇C端殘基，盡量減少消旋的風險，還應考慮在固相上合成的片段的純度要高，溶解性要好；參與縮合的片段的C端和N端殘基的空間位阻要小，以提高片段間的縮合率。

鑒于利西拉來重要的藥學應用價值，有必要提供更有效的利西拉來合成方案，能夠克服以上方法的缺陷并適合工業規模的生產。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種新的利西拉來的制備方法，該方法能夠克服現有制備方法的不足與缺陷，并適合工業化生產。

本發明中利西拉來的制備方法，采用的是固相合成片段和片段液相縮合的組合技術。首先利用固相化學在樹脂載體上合成利西拉來的3個側鏈保護的中間體片段肽：片段a(1-17)，片段b(18-29)，片段c(30-44)，然后在液相中將側鏈保護的中間體片段肽縮合，最后脫除氨基端及側鏈保護基得到利西拉來。本方法中選擇了適宜的3個片段肽，通過常規固相合成法均可以高效率、高產率、高純度的獲得各個片段肽；各個片段肽在液相縮合體系中溶解度高，且參與縮合的片段的C端和N端空間位阻小，縮合產率高，產物易于純化。

具體而言，本發明提供的利西拉來制備方法，包括以下步驟：