[發明專利]一種使用固相和液相組合技術制備利西拉來的方法

在審

• 申請號: 201310731786.X
• 申請日: 2013-12-27
• 公開（公告）號: CN103819553A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 蘇賢斌;林山;俞侖
• 申請（專利權）人: 蘇賢斌
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C07K1/06;C07K1/04;C07K1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用固相和液相組合技術制備利西拉來的方法，利西拉來的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，?

所述方法包括以下步驟：?

(1)以氨基樹脂為載體，按照Fmoc固相合成方法，將具有側鏈保護基團的氨基酸從肽鏈碳端到氮端依次偶聯，獲得側鏈保護的肽中間體片段a(AA₃₀-AA₄₄)的氨基樹脂；?

(2)以三苯甲基樹脂為載體，按照Fmoc固相合成方法，將具有側鏈保護基團的氨基酸從肽鏈碳端到氮端依次偶聯，獲得側鏈保護的肽中間體片段b(AA₁₈-AA₂₉)的三苯甲基樹脂；?

(3)以三苯甲基樹脂為載體，按照Fmoc固相合成方法，將具有側鏈保護基團的氨基酸從肽鏈碳端到氮端依次偶聯，獲得側鏈保護的肽中間體片段c(AA₁-AA₁₇)的三苯甲基樹脂；?

(4)將側鏈保護的肽中間體片段a、b、c從樹脂上切割下來，在溶液中進行縮合反應，得到側鏈保護肽(c-b-a)；?

(5)脫除側鏈保護肽(c-b-a)的側鏈保護基和N端組氨酸上的α-氨基的Boc保護基，得到利西拉來粗肽；?

(6)純化后得到利西拉來；?

所述具有保護基團的氨基酸中，N端第1位組氨酸的α-氨基的保護基為Boc，其余氨基酸的α-氨基的保護基為Fmoc，賴氨酸與色氨酸的側鏈保護基團為Boc，組氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的側鏈保護基團為Trt，天冬氨酸與谷氨酸的側鏈保護基團為OtBu，蘇氨酸與絲氨酸的側鏈保護基團為tBu，精氨酸的側鏈保護基團為Pbf。?

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所用的氨基樹脂為9-Fmoc-氨基呫噸-3-氧基聚苯乙烯樹脂[9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-polystyrene(Sieber?Amide樹脂)]或9-Fmoc-氨基呫噸-3-氧基乙酰甲基樹脂(9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-acetamidomethyl?Resin)，優選Sieber?Amide樹脂。?

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)-(3)中所用的三苯甲基樹脂為2-氯-三苯甲基氯樹脂(CTC樹脂)，氯化三苯甲基樹脂，4-甲基氯化三苯甲基樹脂或4-甲氧基氯化三苯甲基樹脂，優選CTC樹脂。?

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)-(3)偶聯溶劑為DCM，DMF或NMP中的任意一個或一個以上的組合；偶聯體系為HOBt、HOAt、HOOBt或Cl-HOBt中的任意一個或多個與DIC的組合，或為HOBt、HOAt、HOOBt或Cl-HOBt中的任意一個或多個與DPIEA或NMM中的任意一個或兩個與HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一個或多個的組合。?

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)包括：?

(4.1)將片段a從樹脂上切割下來，脫除氨基Fmoc保護基；將片段b從樹脂上切割下來，二者在溶液中縮合，得到片段(b-a)；?

(4.2)脫除片段(b-a)的氨基Fmoc保護基，與從樹脂上切割下來的c片段在溶液中縮合，得到側鏈保護肽(c-b-a)。?

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所用的溶劑為NMP或DMF，縮合體系為DCC與HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一個或一個以上的組合，或者DIEA與HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一個或一個以上的組合與HBTU，HATU，PyBOP或PyAOP中的任意一個或一個以上的組合組成的縮合體系。?

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中把側鏈保護的肽中間體片段a、b、c從樹脂上切割下來所用的是含有1％-5％三氟乙酸的DCM溶液。?

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中脫除側鏈保護肽(c-b-a)的側鏈保護基和N端組氨酸上的α-氨基的Boc保護基所用的是三氟乙酸、1，2-乙二硫醇、水和三異丙基硅烷的混合溶液，其體積比為(90-95)∶(2-5)∶(2-5)∶(1-5)。?