[發明專利]一種穩定、高產α-轉移葡萄糖苷酶的菌株

有效

• 申請號: 201310731295.5
• 申請日: 2013-12-26
• 公開（公告）號: CN103695323A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 王華明;訾禎禎
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司;中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N9/10;C12P19/18;C12R1/685
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于微生物誘變篩選技術領域，具體涉及一種穩定、高效異源表達α-轉移葡萄糖苷酶的黑曲霉（Asperillus?niger）菌株及其應用。

背景技術

α-轉移葡萄糖苷酶(α-transglucosidase?E.C.2.4.1.24)屬于鍵專一性酶，它可專一性地切開糖類底物分子中非還原端的α-1、4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，或將游離出的葡萄糖殘基以α-1、6糖苷鍵轉移到另一個糖類底物上，從而得到非發酵性的低聚異麥芽糖(簡稱IMO，主要包括異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖及四糖以上的低聚糖)、糖脂或糖肽等。在低聚異麥芽糖的生產中，利用α-轉移葡萄糖苷酶的水解作用和其轉苷作用是生產低聚異麥芽糖的關鍵。因此α-轉移葡萄糖苷酶倍受國內外食品工業界的重視。

α-轉移葡萄糖苷酶在自然界中分布廣泛，種類繁多，性質各異，幾乎存在于所有生物體內，在人類的糖原降解及動物、植物和微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能。α轉移葡萄糖苷酶主要應用于生產IMO，而IMO是人類腸道有益菌群雙歧桿菌的增殖因子，攝入后不被人體消化吸收，也不易被大腸中的多數腐敗細菌所利用，卻能作為雙歧桿菌的碳源而被利用，具有促進腸道有益菌群增值、潤腸通便、調節血脂、低甜度、低熱量等獨特功效，尤其是在促進腸道有益菌群的增值方面功效顯著。作為一種功能性食品原料，IMO已被廣泛用于各種食品的制造如乳制品、糖果類、焙烤食品等，居各種功能性低聚糖之首。

目前工業上已經有以淀粉或麥芽糖為原料，通過酶法生產低聚異麥芽糖的工藝，但是已有的生產工藝轉化率并不高。此外，雖然我國異麥芽糖產量很高，α轉移葡萄糖苷酶的用量很大，但卻一直沒有實現工業化生產，該酶仍然依賴進口，這些因素都極大制約了國內低聚異麥芽糖的生產。因此，本領域亟需獲得高活性的α轉移葡萄糖苷酶及其相應的高產量的α轉移葡萄糖苷酶生產菌株，以適應低聚異麥芽糖生產工藝的需要。

發明內容

本發明的目的是提供一種穩定、高產α-轉移葡萄糖苷酶的菌株及其應用。本發明將構建得到的重組表達α-轉移葡萄糖苷酶的黑曲霉工程菌株進行紫外誘變和突變篩選，從而得到了一株穩定性好、α-轉移葡萄糖苷酶產量高的黑曲霉突變株，為α-轉移葡萄糖苷酶的工業化生產奠定了基礎，從而彌補現有技術的不足。

本發明一方面提供了一株突變菌株，黑曲霉Anm2（Aspergillus?niger），已于2013年12月9日保藏于北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），菌株保藏編號為CGMCC?No.8541。

所述黑曲霉Anm2在生產α-轉移葡萄糖苷酶中的應用。

本發明還提供了上述α-轉移葡萄糖苷酶在食品加工領域中的應用。

本發明提供的突變菌株黑曲霉Anm2能高效重組表達α-轉移葡萄糖苷酶，其發酵酶活高達23709U/mL，比出發菌提高了54%。所述α-轉移葡萄糖苷酶的最適作用溫度為60℃，最適作用pH值為5.0。所生產的α-轉移葡萄糖苷酶可廣泛應用于低聚異麥芽糖漿的生產。

附圖說明

圖1：pGm-An重組質粒的遺傳圖譜；

圖2：突變菌株黑曲霉Anm2發酵上清液SDS-PAGE電泳檢測圖，其中泳道M所示為蛋白標準分子量標記，由上至下為116.0kDa，66.2kDa，45.0kDa，35.0kDa，25.0kDa和18.4kDa；泳道1所示為出發菌株黑曲霉An1發酵上清液中蛋白表達情況；泳道2所示為突變菌株黑曲霉Anm2發酵上清液中蛋白表達情況，箭頭所指109kDa處的蛋白條帶即為重組表達的α-轉移葡萄糖苷酶；

圖3：α-轉移葡萄糖苷酶的作用pH-相對酶活曲線圖；

圖4：α-轉移葡萄糖苷酶的作用溫度-相對酶活曲線圖。

具體實施方式

本發明用到了在遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法。例如MOLECULAR?CLONING:A?LABORATORY?MANUAL,3nd?Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT?PROTOCOLS?IN?MOLECULAR?BIOLOGY(Ausubel,2003)等參考書中所記載的技術。但是，這并不意味著將本發明限定于所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，本領域的普通技術人員可以選用已公開的技術來實施本發明實施例中記載的方案。