[發明專利]一種誘導小鼠誘導型多能干細胞骨向分化的方法及其培養基

在審

• 申請號: 201310731226.4
• 申請日: 2013-12-26
• 公開（公告）號: CN103710310A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 張宇;劉忠華;史久慧;邢艦譽
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/077
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及了一種誘導小鼠誘導型多能干細胞骨向分化的方法及其培養基，屬于生物技術領域。

技術背景

多能性干細胞是指具有形成動物個體所有類型細胞的多向分化潛能，并能夠不斷自我更新的一類細胞。它們一方面通過細胞分裂維持自身群體的大小或擴增，另一方面可以進一步分化為特異的細胞類型。由于多能性干細胞的上述特性，使其在細胞替代治療、基因治療、發育生物學、藥理學等領域發揮著獨特的作用和優勢。目前，多能性干細胞根據其來源分為三類：來源于胚胎囊胚內細胞團的胚胎干細胞（embryonic?stem?cell，ES）、來源于胚胎生殖嵴原始生殖細胞的胚胎生殖細胞(embryonic?germ?cell，EGC)和通過體細胞重編程而獲得的誘導型多能干細胞（induced?pluripotent?stem?cell，iPS）。由于ES和EG細胞來源于發育期的胚胎，它們的獲得，特別是人類ES及EG細胞的獲得引發了許多倫理學上的爭議。另外，將ES及EG細胞應用到人類臨床治療還面臨著免疫排斥的風險。這兩點限制了ES及EG細胞在臨床醫學及基礎科學領域的應用。

2006年，Yamanaka等首次將Oct4、Sox2、Klf4及c-myc導入小鼠皮膚成纖維細胞獲得了類似于小鼠ES細胞的iPS細胞系（Takahashi?and?Yamanaka,2006），經證實，這類細胞能夠參與正常胚胎發育和組織器官的形成，并獲得了生殖系嵌合的小鼠（Zhao?et?al.，2009）。2007年，Thomson實驗室和Yamanaka實驗室幾乎同時宣布了人類iPS細胞系的建立（Yu?et?al.,2007；Takahashi?et?al.,2007）。此后，iPS細胞的研究得到了迅速發展，到目前為止，小鼠、大鼠、兔、狗、豬、猴、人等物種的iPS細胞系都已成功建立，并且它們在形態學、表觀遺傳學、全基因組表達圖譜及分化能力等方面均表現出與其ES細胞相似的特性。iPS技術的建立，使最初基于胚胎和卵母細胞的“治療性克隆”的設想在體細胞上得到了實現-通過體外建立、擴增及定向誘導iPS細胞可以獲得足夠數量的目標細胞用于細胞移植治療和基因治療，并且這一系列操作均不受倫理學上的限制。另外，獲得病人特異的iPS細胞也可以避免外源移植引起的免疫排斥、交叉感染的風險。這一思路為許多細胞缺損性疾病的治療帶來了新的希望，例如：進行性肌營養不良、老年癡呆癥、糖尿病、骨質疏松癥、心肌梗死等。

現已證明，iPS細胞在適當的培養條件下可以分化為多種細胞類型，如：肌肉細胞（Zhang?et?al.,2009）、脂肪細胞（Tashiro?et?al.,2009）、胰腺細胞（Tateishi?et?al.,2008）、造血細胞（Chio?et?al.,2009）、神經細胞（Chamber?et?al.,2009）、成骨細胞等（Pepoo?et?al.,2009；Tashiro?et?al.,2009）。但現有的定向誘導技術普遍存在著培養基成分不明確、分化細胞純度低的問題。此外，要想達到臨床標準，研究者們在優化培養體系的同時，還應該對移植細胞的致瘤性、有效性進行評價，而這些檢測顯然不能在人類上進行。作為最常用的模式動物，現代醫學中90%的亞臨床試驗實是在小鼠中開展的。小鼠生長周期短、譜系明確，其發育機制普遍通用于哺乳動物。所以，通過對小鼠iPS細胞骨誘導條件的優化，一方面有利于后期檢測中自體移植試驗的開展，另一方面將為人類細胞骨誘導條件的優化和骨再生醫學的研究提供有益參考。

發明內容

本發明提供了一種誘導小鼠誘導型多能干細胞骨向分化的培養基，采用的技術方案如下：

一種誘導小鼠iPS細胞骨向分化的培養基由分化培養基I和分化培養基II組成，其中分化培養基I是在成纖維細胞培養基基礎上添加全反式維甲酸和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）制得，分化培養基II是在成骨細胞培養基的基礎上降低D-葡萄糖含量，并添加BMP4或BMP7制得。

優選地，所述培養基由以下兩種培養基組成：

分化培養基I是在成纖維細胞培養基的基礎上添加10^-8-10^-7mol/L的全反式維甲酸（美國Sigma公司）和3-10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子（美國Peprotech公司），pH7.0-7.4；