[發(fā)明專利]一種誘導小鼠誘導型多能干細胞骨向分化的方法及其培養(yǎng)基

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310731226.4
• 申請日: 2013-12-26
• 公開（公告）號: CN103710310A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設計）人: 張宇;劉忠華;史久慧;邢艦譽
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/077
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種誘導小鼠誘導型多能干細胞骨向分化的培養(yǎng)基，其特征在于，由分化培養(yǎng)基I和分化培養(yǎng)基II組成，其中分化培養(yǎng)基I是在成纖維細胞培養(yǎng)基基礎上添加全反式維甲酸和堿性成纖維細胞生長因子制得，分化培養(yǎng)基II是在成骨細胞培養(yǎng)基的基礎上降低D-葡萄糖含量，并添加BMP4或BMP7制得。

2.權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基，其特征在于，所述分化培養(yǎng)基I是在成纖維細胞培養(yǎng)基的基礎上添加10^-8-10^-7mol/L的全反式維甲酸和3-10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，pH7.0-7.4；所述分化培養(yǎng)基II是在成骨細胞培養(yǎng)基的基礎上降低D-葡萄糖含量為原濃度的20-40%，并添加60-120ng/mL?BMP4或40-120ng/mL?BMP7，pH7.0-7.4。

3.權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基，其特征在于，所述成纖維細胞培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基。

4.權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基，其特征在于，所述成骨細胞培養(yǎng)基為含有10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、50mg/L抗壞血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、10^-8mol/L地塞米松的高糖DMEM培養(yǎng)基。

5.權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基，其特征在于，分化培養(yǎng)基I是添加5×10^-8mol/mL的全反式維甲酸和10ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子，含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，pH7.0-7.4；分化培養(yǎng)基II是添加100ng/mL?BMP4或100ng/mL?BMP7，含有10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、50mg/L抗壞血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、10^-8mol/L地塞米松，葡萄糖含量為原濃度25%的高糖DMEM培養(yǎng)基，pH7.0-7.4。

6.一種誘導小鼠誘導型多能干細胞分化為成骨細胞的方法，其特征在于，步驟如下：

1）將小鼠誘導型多能干細胞接種到超低粘附培養(yǎng)皿中，加入分化培養(yǎng)基I，培養(yǎng)3-6天，形成間質(zhì)細胞富集的擬胚體；

所述分化培養(yǎng)基I組成為：是在成纖維細胞培養(yǎng)基的基礎上添加10^-8-10^-7mol/L的全反式維甲酸和3-10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，pH7.0-7.4；

2）將步驟1)所得擬胚體離心分離后，收集擬胚體并添加分化培養(yǎng)基II，吹打后接入到明膠鋪底的培養(yǎng)皿中，補充分化培養(yǎng)基II，培養(yǎng)并隔天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)7-14天，得成骨細胞；

所述分化培養(yǎng)基II組成為：是在成骨細胞培養(yǎng)基的基礎上降低D-葡萄糖含量為原濃度的20-40%，并添加60-120ng/mL?BMP4或40-120ng/mLBMP7，pH7.0-7.4。

7.權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述步驟1）中，培養(yǎng)時間5天。

8.權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述步驟2）中，培養(yǎng)時間14天，且第一次更換培養(yǎng)基時，用37℃溫浴的PBS清洗1-3次。

9.權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，步驟1）和步驟2）中分化培養(yǎng)基培養(yǎng)的溫度為37℃，含有5%CO₂。

10.權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，具體步驟如下：

1）間質(zhì)細胞富集的擬胚體的誘導：利用差速貼壁法去除飼養(yǎng)層細胞，獲得純凈的小鼠誘導型多能干細胞，將所得到的小鼠誘導型多能干細胞以2×10⁵個/mL的密度接種到超低粘附培養(yǎng)皿中，加入分化培養(yǎng)基I，于37℃、5%CO₂條件下培養(yǎng)，從第2天起，每天搖動培養(yǎng)基2次，從第3天開始，每天補加10ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子，培養(yǎng)5天形成擬胚體；

所述分化培養(yǎng)基I組成為：是在成纖維細胞培養(yǎng)基的基礎上添加5×10^-8mol/L的全反式維甲酸和10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，pH7.0-7.4；

2）成骨細胞的誘導：將步驟1）所得擬胚體于1200rpm下離心1min，收集擬胚體并添加少量分化培養(yǎng)基，機械吹打為小細胞團塊后接種到明膠鋪底的培養(yǎng)皿中，補充分化培養(yǎng)基II，于37℃、5%CO₂條件下培養(yǎng)并隔天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天，獲得成骨細胞；所述分化培養(yǎng)基II組成為：是在成骨細胞培養(yǎng)基的基礎上降低D-葡萄糖含量為原濃度的25%，并添加100ng/mL?BMP4或100ng/mLBMP7，pH7.0-7.4。