[發明專利]一種適用于雙向電泳實驗的蚯蚓總蛋白的提取方法

有效

• 申請號: 201310730874.8
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN103728171A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 趙化冰;郭錦;楊震;佟巍;胡驍;張麗;高宏生;王毅錚;張國輝;周啟星
• 申請（專利權）人: 中國人民武裝警察部隊后勤學院
• 主分類號: G01N1/34
• 分類號: G01N1/34
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明涉及一種適用于雙向電泳實驗的蚯蚓總蛋白的提取方法。

背景技術

蛋白樣品的制備在整個蛋白質組學研究當中占據非常重要的地位，也是決定實驗成敗的關鍵因素，樣品質量的好壞，直接決定了下游實驗的結果。理想的蛋白樣品制備方法應當是以最大限度的溶解全部蛋白質，盡量采用最少的操作步驟，盡量避免蛋白質的丟失、降解和改變，盡量降低雜質對蛋白質的污染，并具有較好的重復性。

對于蚯蚓總蛋白的提取，難度在于蚯蚓總蛋白是用整條個體進行提取，因此其體內的脂類、多糖和酚類等代謝產物或次生代謝產物，以及多種的氧化酶和蛋白酶，都會在一定程度上影響到總蛋白提取的純度和質量。

發明內容

本發明的目的是提供一種提取率高的適用于雙向電泳實驗的蚯蚓總蛋白的提取方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種適用于雙向電泳實驗的蚯蚓總蛋白的提取方法，包括如下步驟：

1）取新鮮或-80℃保存的蚯蚓在預冷的研缽中用液氮研磨成蚯蚓粉末；

2）取1g蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，渦旋2-6分鐘混勻，于-20℃沉淀6-16小時；離心，棄上清，加入10-30ml質量濃度為0.3%二硫蘇糖醇的丙酮溶液洗滌沉淀，洗滌后于4℃，離心30分鐘，再重復洗滌、離心操作2次；

3）用質量濃度為0.3%的二硫蘇糖醇溶液洗滌沉淀，12000×g的離心條件下，離心30分鐘，棄上清，揮干沉淀中殘余的液體，所述二硫蘇糖醇溶液的溶劑為體積濃度為70%-90%的丙酮水溶液；

4）取0.1-0.3g步驟（3）獲得的沉淀溶解于1ml蛋白裂解液中，渦旋混勻，冰浴靜置5分鐘；加入二硫蘇糖醇使其終濃度為40-100mM，渦旋混勻，冰上靜置10分鐘；

5）冰浴下，以250-350W功率，2s/6s超聲25-35個循環，13500×g離心40分鐘，取上清-80℃分裝保存；

所述蛋白提取液用下述方法制成：取10-30g三氯乙酸和0.3g二硫蘇糖醇加丙酮至100ml溶解；

所述蛋白裂解液用下述方法制成：取4.2g尿素、1.52g硫脲和0.2g3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸用去離子水定容至10ml。

步驟（2）優選為：取1g蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，渦旋4分鐘混勻，于-20℃沉淀10小時；離心，棄上清，加入25ml質量濃度為0.3%二硫蘇糖醇的丙酮溶液洗滌沉淀，洗滌后于4℃，離心30分鐘，再重復洗滌、離心操作1次。

優選的蛋白提取液用下述方法制成：取20g三氯乙酸和0.3g二硫蘇糖醇加丙酮至100ml溶解。

步驟（3）優選為：用質量濃度為0.3%的二硫蘇糖醇溶液洗滌沉淀，12000×g的離心條件下，離心30分鐘，所述二硫蘇糖醇溶液的溶劑為體積濃度為80%的丙酮水溶液；揮干液體。

步驟（4）優選為：取0.1-0.3g步驟（3）獲得的沉淀溶解于1ml蛋白裂解液中，渦旋混勻，冰浴靜置5分鐘；加入二硫蘇糖醇使其終濃度為65mM，渦旋混勻，冰上靜置10分鐘。

步驟（5）優選為：冰浴下，以300W功率，2s/6s超聲30個循環，13500×g離心40分鐘，取上清-80℃分裝保存。

優點：

本發明的方法在操作步驟少，耗時短，簡單易行的基礎上，彌補了單一溶劑沉淀不能夠有效地去除蚯蚓樣品當中的脂類、多糖和酚類等雜質的不足。此方法處理得到的雙向電泳譜圖中，蛋白點能夠分布在一個寬泛的等電點和分子量范圍內。

附圖說明

圖1為實施例1提取的蚯蚓總蛋白的電泳圖。

圖2為實施例2提取的蚯蚓總蛋白的電泳圖。

圖3為實施例3提取的蚯蚓總蛋白的電泳圖。

圖4為對比例1提取的蚯蚓總蛋白的電泳圖。

具體實施方式

以下案例便于更好地理解本發明，實施案例中的實驗方法，如無特殊說明均為常規操作。下屬實施案例中所用的試劑材料，如無特殊說明，均購自常規生化試劑公司。以下實施案例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。