[發(fā)明專利]一種適用于雙向電泳實驗的蚯蚓總蛋白的提取方法

有效

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• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN103728171A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設計）人: 趙化冰;郭錦;楊震;佟巍;胡驍;張麗;高宏生;王毅錚;張國輝;周啟星
• 申請（專利權）人: 中國人民武裝警察部隊后勤學院
• 主分類號: G01N1/34
• 分類號: G01N1/34
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種適用于雙向電泳實驗的蚯蚓總蛋白的提取方法，其特征是包括如下步驟：

1）取新鮮或-80℃保存的蚯蚓在預冷的研缽中用液氮研磨成蚯蚓粉末；

2）取1g蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，渦旋2-6分鐘混勻，于-20℃沉淀6-16小時；離心，棄上清，加入10-30ml質量濃度為0.3%二硫蘇糖醇的丙酮溶液洗滌沉淀，洗滌后于4℃，離心30分鐘，再重復洗滌、離心操作2次；

3）用質量濃度為0.3%的二硫蘇糖醇溶液洗滌沉淀，12000×g的離心條件下，離心30分鐘，棄上清，揮干沉淀中殘余的液體，所述二硫蘇糖醇溶液的溶劑為體積濃度為70%-90%的丙酮水溶液；

4）取0.1-0.3g步驟（3）獲得的沉淀溶解于1ml蛋白裂解液中，渦旋混勻，冰浴靜置5分鐘；加入二硫蘇糖醇使其終濃度為40-100mM，渦旋混勻，冰上靜置10分鐘；

5）冰浴下，以250-350W功率，2s/6s超聲25-35個循環(huán)，13500×g離心40分鐘，取上清-80℃分裝保存；

所述蛋白提取液用下述方法制成：取10-30g三氯乙酸和0.3g二硫蘇糖醇加丙酮至100ml溶解；

所述蛋白裂解液用下述方法制成：取4.2g尿素、1.52g硫脲和0.2g3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸用去離子水定容至10ml。

2.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟（2）為：取1g蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，渦旋4分鐘混勻，于-20℃沉淀10小時；離心，棄上清，加入20ml質量濃度為0.3%二硫蘇糖醇的丙酮溶液洗滌沉淀，洗滌后于4℃，離心30分鐘，再重復洗滌、離心操作1次。

3.根據權利要求1或2所述的提取方法，其特征在于所述蛋白提取液用下述方法制成：取20g三氯乙酸和0.3g二硫蘇糖醇加丙酮至100ml溶解。

4.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟（3）為：用質量濃度為0.3%的二硫蘇糖醇溶液洗滌沉淀，12000×g的離心條件下，離心30分鐘，所述二硫蘇糖醇溶液的溶劑為體積濃度為80%的丙酮水溶液；揮干液體。

5.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟（4）為：取0.1g步驟（3）獲得的沉淀溶解于1ml蛋白裂解液中，渦旋混勻，冰浴靜置5分鐘；加入二硫蘇糖醇使其終濃度為65mM，渦旋混勻，冰上靜置10分鐘。

6.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟（5）為：冰浴下，以300W功率，2s/6s超聲30個循環(huán)，13500×g離心40分鐘，取上清-80℃分裝保存。