[發明專利]一種從尿液中制備人血白蛋白的方法

有效

• 申請號: 201310729720.7
• 申請日: 2013-12-26
• 公開（公告）號: CN103694343A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 苗丕渠;侯曉彥;池正昌;沈小寧
• 申請（專利權）人: 揚州艾迪生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 謝東

技術領域

本發明涉及人血白蛋白的制造領域，尤其涉及一種從尿液中制備人血白蛋白的方法。

背景技術

人血白蛋白（Human?Serum?Albumin，HSA）是人體血液中最重要的一種功能性蛋白質，其主要生理功能為維持血液滲透壓，結合并運輸小分子營養物質和藥物。HSA是目前用量最大的一種蛋白藥物，臨床上用于治療低蛋白血癥、慢性腎炎、肝炎、肝硬化和晚期惡性腫瘤等疾病，此外，人血白蛋白還用作賦形劑和穩定劑、生產疫苗的免疫佐劑、無血清細胞培養基的組分等。

人血白蛋白主要來源于血漿，據2012年市場統計資料顯示，全球每年人血白蛋白需求量達600?噸以上，除美國外，其他國家大多數需要依靠部分進口，以滿足需求。目前，我國的年需求量約為170噸左右，其中臨床用量120噸左右，疫苗生產企業用量約40噸左右，隨著我國疫苗需求量的增加，培養基級白蛋白用量迅速擴大，預計未來白蛋白市場需求將升至250噸以上，由于我國血漿供給的制約等因素，市場缺口非常大，因此，進一步擴展白蛋白的來源成為業界亟待解決的問題。目前，白蛋白的基因工程產品取得了較大的進展，EP0612761、EP0570916、US6638740B1等均公開了純化重組人血白蛋白的方法，但這些方法制得的白蛋白容易殘留微量異源蛋白引起過敏等副反應，存在重組白蛋白生理功能不確定的缺陷容易引起不可知隱患，因此其應用受到嚴重的限制。

資料顯示，人尿中也含有白蛋白，其結構、理化性質與人血白蛋白完全一致（劉蘭英等,1984,吉林大學自然科學學報,122-126），因此人尿來源的白蛋白若能得到開發利用，可在一定程度上替代血漿來源的白蛋白，從而緩解白蛋白市場的緊張局面。

本發明以中國專利ZL201010106302.9為基礎，通過樹脂在線吸附富集白蛋白等尿蛋白，并通過應用現代層析技術成功實現白蛋白的純化，成本低，收率高，無免疫原性，質量穩定，適合大規模生產操作，為白蛋白的來源開辟了一條全新的渠道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術存在的不足，提供一種從尿液中制備人血白蛋白的方法，成本低，收率高，無免疫原性，SDS-PAGE顯示為單一條帶，HPLC顯示不含多聚體，質量穩定，適合大規模生產操作，為白蛋白的來源開辟了一條全新的渠道。

為實現上述目的，本發明從尿液中制備人血白蛋白的方法技術方案是：

一種從尿液中制備人血白蛋白的方法，收集已吸附尿蛋白的樹脂，進行清洗處理，還包括如下步驟：?

a)????????尿蛋白解吸附，得到尿蛋白濃縮液；

b)????????采用平衡液平衡好的金屬螯合親和層析柱層析，沖洗液洗脫收集洗脫峰；?

c)????????采用平衡液平衡好的陰離子層析柱層析，上樣上一步的洗脫峰，沖洗液洗脫收集洗脫峰；?

d)???????采用平衡液平衡好的疏水層析柱層析，上樣上一步的洗脫峰，沖洗液洗脫收集洗脫峰；?

e)????????采用平衡液平衡好的陰離子交換層析，上樣上一步的洗脫峰，沖洗液洗脫收集洗脫峰，得到人血白蛋白。

步驟a）利用0.5－1.5M的NaCl溶液進行尿蛋白的解吸附。

步驟d）和步驟e）之間增加一個去病毒步驟，調節步驟d）中的洗脫液蛋白質濃度至20%－25%，加入辛酸鈉作為保護劑，進行60℃加熱處理10小時。

步驟b）中金屬螯合親和層析柱的螯合金屬離子是Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺中的任意一種。優選Cu²⁺。

步驟b）中尿蛋白濃縮液上金屬螯合親和層析柱之前超濾濃縮，調節pH4－8，電導0.5－10mS/cm，平衡液為0.02－0.2M醋酸鹽或磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.2－2.0M，洗脫液為?0.02－0.2M磷酸鹽溶液，0.5－1.5M?NH₄Cl，pH6.0－8.4。平衡液優選0.02M醋酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.5M，洗脫液優選配0.02M?磷酸鹽，1.0M?NH₄Cl，pH8.0。

在洗脫之前加入沖洗步驟，用pH5.0－8.0，NH₄Cl濃度≤0.5M的沖洗液沖洗金屬螯合親和層析柱，所述的沖洗液緩沖介質為0.02－0.2M磷酸鹽或者醋酸鹽。沖洗液優選0.02M?磷酸鹽，0.2M?NH₄Cl，pH6.0。