[發明專利]一種提高棲熱菌海藻糖合成酶含量的方法

有效

• 申請號: 201310729535.8
• 申請日: 2013-12-26
• 公開（公告）號: CN103695407A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 董永勝;馬蕾;段元良
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種提高棲熱菌海藻糖合成酶含量的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

海藻糖合成酶（Trehalose?synthase，EC5.4.99.16）是一種分子內葡糖苷轉移酶，能夠特異性地催化麥芽糖的α-1,4糖苷鍵轉化為α-1,1糖苷鍵生成海藻糖。海藻糖是由兩個葡萄糖分子通過半縮醛羥基縮合而成的一種非還原性雙糖，具有在逆境下保護生物體的生物膜和生物大分子的特殊功能，能賦予低等動物、植物和微生物等抵抗營養缺乏、高溫、高滲透壓、干燥、有毒物質等惡劣環境的能力，因而在生物制品、食品、藥品、作物育種及精細化工等領域有著廣泛的應用前景。

酶合成法是生產海藻糖的主要方法之一，是利用酶制劑所具有的轉糖基作用在離體條件下作用于麥芽糖、蔗糖等底物生產海藻糖，該方法具有較高的特異性、快速溫和、生產成本低等特點。酶法生產海藻糖有多種生物合成途徑，可由不同的酶分別催化淀粉、葡萄糖、麥芽糖、寡糖等合成海藻糖。

利用海藻糖合成酶以麥芽糖為底物合成海藻糖的流程僅需一步反應，海藻糖的產率高且不受底物麥芽糖濃度的影響，工藝簡單，易于調控，是酶法生產海藻糖的最簡單途徑，因而海藻糖合成酶已被廣泛應用于海藻糖的工業化生產。在恥垢分枝桿菌(Mycobacterium?smegmatis)、脂肪桿菌（Pimelobacter?sp.）、食尼古丁節桿菌?(Arthrobacter?nicotinovorus)、惡臭假單胞菌（Pseudomonas?putida）和一些棲熱菌?（Thermus）等菌株中都發現了海藻糖合成酶，但上述菌株細胞內的海藻糖合成酶含量低，酶的活性低，導致酶的生產成本較高，因此如何提高海藻糖合成酶的含量、降低生產成本是目前急需解決的技術問題。

研究發現當微生物細胞處于饑餓、高溫、高滲透壓等外界刺激時會發生應激反應，提高細胞內合成海藻糖酶系的活性，從而增加海藻糖產量以抵抗外界脅迫。目前對部分微生物在上述條件下細胞內海藻糖和海藻糖合成酶的變化已有一定的研究，如段作營（生物加工過程，2007.5）在進行熱激對惡臭假單胞菌S1胞內海藻糖合成酶的影響研究時，采用熱刺激的方法使海藻糖合成酶的酶活提高了76%；如中國專利文獻CN?12190715A（申請號03129701.3）公開了一種以葡萄糖為基質兩步發酵法生產酵母胞外海藻糖的方法，首先采用氮饑餓、熱休克、滲透脅迫等方法，誘導酵母細胞產生較多的應激酶-海藻糖合成酶系，然后利用酵母細胞中的海藻糖合成酶系大量合成胞外海藻糖；外界壓力也是一種刺激條件，生物反應器的壓力對微生物胞內特定產物的含量也有顯著影響，如中國專利文獻CN?1480535A（申請號03130410.9）公開了利用高壓提高酵母菌海藻糖產量的方法，該方法較常壓對照條件下胞內海藻糖含量提高了20～70%。目前關于利用壓力提高棲熱菌海藻糖合成酶含量的研究還沒有相關報道或專利。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種提高棲熱菌海藻糖合成酶含量的方法。

本發明采用的技術方案為：

一種提高棲熱菌海藻糖合成酶含量的方法，其特征是，步驟如下：

（1）從試管斜面上挑取1-2環棲熱菌菌株接種到液體種子培養基中，在65～70℃、100～150r/min下培養12～16h，制得活化后的液體種子，然后將液體種子按體積比3%～5%的接種量接種到液體培養基中，在60～70℃、150～200r/min下培養20～24h，制得菌株細胞培養液；

（2）將菌株細胞培養液置于壓力反應器內，在0.5～2.0MPa壓力下發酵1～6h，發酵條件為60～70℃、150～200r/min，制得發酵液；

（3）將發酵液離心，收集菌體細胞，破碎細胞，制得細胞破碎液，然后將細胞破碎液采用雙水相萃取體系制備海藻糖合成酶。

所述步驟（1）中的棲熱菌菌株為水生棲熱菌（Thermus?aquaticus?）ATCC33923或棲熱菌屬菌(Thermus?sp.)?ATCC?43815，以上菌株均保藏于美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC），可以通過購買的方式獲得。

所述步驟（1）中的液體種子培養基的組分為：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，pH7.5，蒸餾水1000mL。