[發明專利]包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法

無效

• 申請號: 201310728846.2
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103710388A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 史向陽;侯文秀;郭睿;孔令丹
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N15/85
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

技術領域

本發明屬于功能化高分子納米載體用于基因轉染領域，特別涉及一種包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法。

背景技術

目前，隨著科技的發展，基因治療為癌癥及一些遺傳性疾病的治療帶來了福音，被認為是未來癌癥治療中最具前景的治療技術。基因治療用于癌癥的治療相對于傳統的基因治療方法的優勢在于：具有高的靶向性，效果顯著，治療過程中病人痛苦少，在治療過程中對正常細胞的損害少。

基因治療的關鍵在于尋找安全高效的基因載體，通常情況下，用于基因傳遞的載體包括病毒載體和非病毒載體。雖然病毒載體的研究開始的早，應用的早，但是隨著研究的深入病毒載體高的免疫源性和高的毒性，限制了病毒載體在基因轉染領域的深入應用。近幾年來，科學研究者開始探索非病毒載體在基因轉染的應用。在非病毒載體中PAMAM樹狀大分子成為目前研究的熱點。這和其特有的有利于基因傳遞的性質有關聯，比如，納米級的球形結構易于被細胞吞噬，豐富的末端氨基可以被賦予不同的功能，內部大的空腔可以包裹金納米顆粒以及其他的一些無機顆粒增加其剛性以及質粒或siRNA的裝載量等。

在目前報道，樹狀大分子高的毒性限制了其在基因轉染領域的應用，為了解決這個難題大多數研究者采用了在樹狀大分子表面接枝一些功能基團比如，乙酰基，PEG和一些氨基酸等希望降低樹狀大分子的毒性同時增加樹狀大分子的基因轉染效率。本課題組前期的研究從樹狀大分子內部大的空腔可以包裹納米顆粒著手，將金納米顆粒包裹到樹狀大分子中形成樹狀大分子包裹納米金顆粒的基因載體，研究結果表明這種對樹狀大分子的改造不但降低了樹狀大分子的毒性而且增加了樹狀大分子的基因轉染效率（Shan?et?al.Biomaterials2012,33,3025-3035）。因此本發明旨在探索結合上述兩種改造第五代樹狀大分子的方式，即在第五代樹狀大分子表面修飾功能分子，同時在樹狀大分子的內部包裹納米金顆粒。為了實現這個設想，我們選擇了將PEG修飾在第五代樹狀大分子的表面能夠增加樹狀大分子的親水性，較低其細胞毒性，同時在樹狀大分子內部包裹納米金顆粒增加第五代樹狀大分子的剛性結構。此外，本發明旨在探索基因治療的新方向，合成的載體不僅用于pDNA的轉染，也用于siRNA的轉染。

檢索國內外相關文獻和專利結果表明：以PEG化的包裹金納米顆粒的PAMAM樹狀大分子為載體，用于基因轉染的方法，尚未見報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法，該方法具有轉染條件溫和，易于操作，轉染效率高等優點，不僅可以用于pDNA轉染，也可以用于siRNA的轉染，在癌癥的治療等方面具有很好的發展前景。

本發明的一種包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法，包括：

（1）將mPEG-COOH溶于DMSO中，用EDC的DMSO溶液活化，得到活化好的mPEG溶液；

稱取第五代PAMAM樹狀大分子（G5.NH₂）溶于DMSO中，按照mPEG-COOH/G5.NH₂摩爾比為10/1，加入活化好的mPEG溶液，室溫下磁力攪拌，反應得到G5.NH₂-mPEG₁₀溶液；

（2）在上述G5.NH₂-mPEG₁₀溶液中逐滴加入HAuCl₄水溶液，攪拌后快速加入NaBH₄溶液，還原反應結束后，將反應產物透析，然后進行冷凍干燥處理，得到反應產物Au⁰-G5.NH₂-mPEG₁₀；

（3）將Au⁰-G5.NH₂-mPEG₁₀與pDNA或siRNA制備載體/基因復合物溶液；

（4）采用上述載體/基因復合物溶液進行細胞轉染。

步驟（1）中所述的mPEG的分子量為2000或5000。

步驟（2）中所用的HAuCl₄與G5.NH₂-mPEG₁₀的摩爾比為25:1或50:1。

步驟（2）中所述的透析為將反應產物在蒸餾水中透析3天，一天3次，采用截留分子量為14000的透析袋。