[發明專利]包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法

無效

• 申請號: 201310728846.2
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103710388A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 史向陽;侯文秀;郭睿;孔令丹
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N15/85
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

1.一種包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法，包括：

（1）將mPEG-COOH溶于DMSO中，用EDC的DMSO溶液活化，得到活化好的mPEG溶液；

稱取第五代PAMAM樹狀大分子溶于DMSO中，按照mPEG-COOH/G5.NH₂摩爾比為10/1，加入活化好的mPEG溶液，室溫下磁力攪拌，反應得到G5.NH₂-mPEG₁₀溶液；

（2）在上述G5.NH₂-mPEG₁₀溶液中逐滴加入HAuCl₄水溶液，攪拌后快速加入NaBH₄溶液，還原反應結束后，將反應產物透析，然后進行冷凍干燥處理，得到反應產物Au⁰-G5.NH₂-mPEG₁₀；

（3）將Au⁰-G5.NH₂-mPEG₁₀與pDNA或siRNA制備載體/基因復合物溶液；

（4）采用上述載體/基因復合物溶液進行細胞轉染。

2.根據權利要求1所述的一種包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法，其特征在于：步驟（1）中所述的mPEG的分子量為2000或5000。

3.根據權利要求1所述的一種包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法，其特征在于：步驟（2）中所用的HAuCl₄與G5.NH₂-mPEG₁₀的摩爾比為25:1或50:1。

4.根據權利要求1所述的一種包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法，其特征在于：步驟（2）中所述的透析為將反應產物在蒸餾水中透析3天，一天3次，采用截留分子量為14000的透析袋。

5.根據權利要求1所述的一種包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法，其特征在于：步驟（2）中所得到的Au⁰-G5.NH₂-mPEG₁₀為{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-mPEG2k₁₀}、{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-mPEG2K₁₀}、{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-mPEG5K₁₀}或{(Au⁰)₅₀-G5.NH₂-mPEG5K₁₀}。

6.根據權利要求1所述的一種包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法，其特征在于：步驟（3）中所述的Au⁰-G5.NH₂-mPEG₁₀與pDNA或siRNA的N/P為0.5:1～10:1，所述的N/P為樹狀大分子的伯氨基與pDNA或siRNA骨架上磷酸基團摩爾比。

7.根據權利要求1所述的一種包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法，其特征在于：步驟（3）中所述的pDNA為含有綠色熒光蛋白基因和熒光素酶基因的pDNA；所述的siRNA為Bcl-2基因的siRNA。

8.根據權利要求1所述的一種包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法，其特征在于：步驟（3）中得到的載體/基因復合物在室溫下孵育20-30min。

9.根據權利要求1所述的一種包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法，其特征在于：步驟（4）中所述的細胞轉染中的細胞為Hela細胞，具體操作為將Hela細胞種植于24孔板，加入含有10%FBS的DMEM培養基，于37℃、5%CO₂培養12-24小時；轉染前更換新鮮無血清DMEM培養基，然后將步驟（3）得到的載體/基因復合物溶液加到24孔板中，搖勻，37℃培養4小時后更換含10%FBS的DMEM培養基，繼續培養24小時。