[發明專利]一種可自我刪除游離載體及其應用

有效

• 申請號: 201310728828.4
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103725710A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 暢飛;方銳;趙馨;李寧;張磊;湯波;王建武
• 申請（專利權）人: 北京濟福霖生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/877;C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及一種可自我刪除游離載體及其應用。

背景技術

豬生理特征與人類相似、及其生命周期長等特點，被認為是理想的動物模型。因此對豬的基因組修飾可以制備類似人類遺傳疾病的研究模型，可以被廣泛的應該用到人類疾病的病理研究以及治療藥物的研發。此外豬肉也是我國人民主要的動物蛋白來源，對于人民的生活水平提高起到關鍵性作用。隨著我國經濟的發展，人民生活生平的提高，中國人豬肉需求量也越來越大，據統計中國每年消費的豬肉量占全世界總量的一半以上。市場的需求擴大，促進了我國現代化規模化養殖業的快速發展。但是同時也提出嚴峻挑戰。在我國，主要畜牧類品種嚴重依賴于進口，豬品種依賴程度接近90%。這意味著生豬養殖的產業的源頭——種畜完全被歐美市場控制，嚴重的威脅到我國的食品安全。培育自主知識產權的豬新品是現階段我國迫切需要解決的農業問題。傳統的遺傳選育方法周期長見效慢，進難以在短期內培育出具有高生產性能豬新品種。自從1997年哺乳動物體細胞克隆技術出現以后，家畜的基因工程育種得到迅速發展，它可以針對單一性狀在短期內迅速的提高家畜的生產性能。早期的基因工程育種，主要是外源基因隨機整合到基因組中，外源基因表達難以調控，而且表達量不穩定，容易產生基因的插入突變，對轉基因動物本身產生不可忽視的安全隱患。鋅指核酸酶（ZFN）、TALEN、CRISPR/Cas9是近些年發展可以用于對復雜的基因組定點改造的分子工具。與傳統的基因打靶相比其制備簡單，而且效率高，被廣泛的應用于人和小鼠細胞的基因組精細修飾。目前，這些編輯技術也被應用到大動物的基因組定點修飾。鋅指核酸酶（ZFN）、TALEN、CRISPR/Cas9基因編輯技術與體細胞克隆結合可以快捷、高效實現的豬的基因組精細修飾，將來會被廣泛應用于豬的生產性能改良和新品種培育。由于豬的胎兒成纖維細胞無法實現單細胞培養，因此在使用鋅指核酸酶（ZFN）、TALEN、CRISPR/Cas9實現豬細胞的基因敲除時，必需要有marker基因的輔助篩選，才能獲得敲除的細胞克隆。目前的方法是用一段含有新霉素抗性基因表達載體與鋅指核酸酶（ZFN）、TALEN或CRISPR/Cas9共轉染篩選，雖然能夠獲得基因敲除的細胞克隆，但是marker基因也同時整合到細胞的基因組中。Marker基因即選擇性標記基因是指在遺傳轉化中能夠使轉化細胞(或個體)從眾多的非轉化細胞中篩選出來的標記基因，它們通?？梢允罐D基因細胞產生對某種選擇劑具有抗性的產物，從而使轉基因細胞在添加這種選擇的培養基上正常生長，而非轉基因細胞由于缺乏抗性則表現出對此選擇劑的敏感由于轉基因效率低，因此marker基因可以對陽性克隆進行篩選和富集。但marker基因主要有以下缺點：第一，這種marker基因對鄰近基因表達都有影響.第二含有marker基因的轉基因動物無法通過動物的生物安全評估，阻礙轉基因豬的商業應用。

雖然marker基因也可以用cre/loxp系統直接刪除，但是刪除marker基因同時在基因組中留下loxp序列，隨機插入的loxp序列很有可能產生基因的插入突變，對機體產生潛在的生物安全隱患，同樣難以通過轉基因動物的安全評估，限制了轉基因動物的生產應用。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種可刪除標記基因又不會產生基因插入突變的可自我刪除的游離載體。

為了實現本發明目的，本發明首先提供一種可自我刪除游離載體，所述游離載體的核心功能區域從5’端到3’端包括：人EF1α啟動子序列，loxp序列，EGFP編碼序列，來源于人β干擾素基因的S/MAR序列，SV40的PolyA序列，小鼠Oct4啟動子驅動Cre基因的表達盒序列，loxp序列。

進一步地，所述游離載體含有篩選標記基因，所述篩選標記基因為抗性基因。

本發明還提供了利用前述游離載體制備無標記基因的基因打靶動物的方法，其具體步驟包括：

1）將所述游離載體與ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9共轉染動物胎兒體細胞，藥物輔助細胞篩選獲得基因敲除細胞克??；

2）將基因敲除細胞作為核移植供體細胞，離體的卵母細胞作為核移植受體細胞，通過核移植技術獲得動物克隆胚胎；克隆胚胎從二細胞期開始表達Oct4基因，同時小鼠Oct4啟動子cre酶的表達，使得cre酶介導的位點專一性重組介導游離載體自我刪除；

3）克隆胚胎通過手術法移入動物子宮內進行妊娠，獲得無標記基因的基因打靶動物。

進一步地，所述動物為豬、牛、羊。