[發明專利]一種可自我刪除游離載體及其應用

有效

• 申請號: 201310728828.4
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103725710A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 暢飛;方銳;趙馨;李寧;張磊;湯波;王建武
• 申請（專利權）人: 北京濟福霖生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/877;C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種可自我刪除游離載體，其特征在于，所述游離載體的核心功能區域從5’端到3’端包括：人EF1α啟動子序列，loxp序列，EGFP編碼序列，來源于人β干擾素基因的S/MAR序列，SV40的PolyA序列，小鼠Oct4啟動子驅動Cre基因的表達盒序列，loxp序列。

2.根據權利要求1所述游離載體，其特征在于，所述游離載體含有篩選標記基因。

3.利用權利要求1或2所述的游離載體制備無標記基因的基因打靶動物的方法，其特征在于，其具體步驟包括：

1）將所述游離載體與ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9共轉染動物胎兒體細胞，藥物輔助細胞篩選獲得基因敲除細胞克隆；

2）將基因敲除細胞作為核移植供體細胞，去核的卵母細胞作為核移植受體細胞，通過核移植技術獲得動物克隆胚胎；克隆胚胎從二細胞期開始表達Oct4基因，同時小鼠Oct4啟動子cre酶的表達，使得cre酶介導的位點專一性重組介導游離載體自我刪除；

3）克隆胚胎通過手術法移入動物子宮內進行妊娠，獲得無標記基因的基因打靶動物。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述動物為豬、牛、羊。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述藥物為G418。

6.根據權利要求1或2所述的游離載體在制備無標記基因動物細胞中的應用。

7.根據權利要求1或2所述的游離載體在制備無標記基因的基因打靶動物中的應用。