[發明專利]醇脫氫酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201310727759.5
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103642765A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 嚴明;許琳;邱曉鸞
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/62
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種可用作手性醇合成催化劑的醇脫氫酶(Alcohol?Dehydrogenase,ADH)突變體及其應用。

背景技術

手性醇(Chiral?Alcohols)在手性藥物、農用化學品以及多種類型的手性材料制備中有廣泛應用。以(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯[(S)-CHBE]為例，(S)-CHBE可用于很多活性藥物的合成，它是對映體選擇性合成Slagenins?B和C以及他汀類藥物--羥甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)還原酶抑制劑的關鍵手性中間體，而且(S)-CHBE還可以轉化生成1,4-二氫吡啶類β-阻滯劑[1]。

羰酰還原酶生物催化法不對稱還原COBE制備(S)-CHBE法因其高效率、高立體選擇性、反應條件溫和以及經濟和社會效益好等優點受到普遍關注^[2]。然而，該反應的進行需要消耗一定量的輔酶--NAD(P)H。這類還原態輔酶往往價格昂貴且穩定性低，從技術經濟角度考慮，生產中投加大量輔酶是不可行的，因此輔酶的高效原位再生成為了發展應用氧化還原酶工業生物催化技術的瓶頸問題。

為了解決輔酶再生的問題，已經提出了酶法、光化學法、電化學法等一系列的方法[3]，其中酶法再生系統因其具有反應速率快、選擇性高、再生體系與合成體系兼容性好、過程易于監控等優點而受到廣泛重視，迄今已報道了多種脫氫酶、氧化酶、氫化酶參與實現的輔酶再生系統，其中甲酸脫氫酶（Formate?dehydrogenase,FDH）是公認的煙酰胺型還原態輔酶再生系統的首選用酶[4-5]。甲酸脫氫酶催化甲酸生成CO₂和H₂O，伴隨一分子的NAD⁺還原為NADH。該反應的底物甲酸廉價易得，且對合成體系的酶影響較小，而生成產物CO₂易于分離，使反應接近不可逆過程，有利于提高酶轉化效率，此外研究表明FDH適宜pH范圍廣泛，易于實現再生系統與合成系統的有效耦聯。然而由于該體系只能實現NADH的再生，而短鏈脫氫酶家族中不少酶都是NADPH依賴型。隨著分子生物學技術和蛋白質結構組學研究的日益發展，采用蛋白質工程技術改變酶的輔酶依賴型，從而很好地與甲酸脫氫酶偶聯應用于輔酶再生體系，是近年來該領域的主要研究方向。

目前已有不少文獻報道了通過定點突變手段實現酶的輔酶特異性的改變。早期的文獻報道大多采用序列比對等較為經驗性的方式獲得突變位點，Katzberg等以酵母還原酶Gre2p為研究對象，將其序列與赭色擲孢酵母羰基還原酶SSCR的序列進行比對，選擇Asn9作為突變位點，采用定點突變技術，獲得突變體N9E，研究該突變酶的輔酶特異性發現，NADH/NADPH的值為0.9，而其野生型的值僅為0.007[6]。采用類似的位點選擇方法的報道還有Zhang等2008年對來自近平滑念珠菌的羰基還原酶SCR所作的研究，選擇了輔酶結合位點附近的Ser67，His68，Pro69作為突變位點。結果顯示，雙位點突變酶S67D/H68D在保留了酶的穩定性與立體選擇性的基礎上，其輔酶依賴型由NADPH依賴型變為更傾向于依賴NADH[7]。隨著生物信息學，蛋白質結構生物學等領域的快速發展，對輔酶結合域的研究越發理性化，越來越多的報道采用計算機輔助技術對蛋白質的結構進行理性設計改造。大連科技大學2010年就研究發表了有關通過理性設計改變輔酶特異性的報道。文獻報道了經通過自由能計算判斷酶與輔酶的結合情況的方式，并采用丙氨酸篩選突變以確定影響輔酶特異性的關鍵位點。在充分的理論分析與理性設計后，獲得Asp41Gly,Asp41Ala兩個突變體，結果顯示突變酶的輔酶特異性均發生顯著改變。從結構上分析該現象的結構性原理顯示突變后削弱了Asp41與磷酸基團之間的酯化作用[8]。同樣的Morikawa等通過計算機輔助手段對來自木蘭假絲酵母的S1進行研究，經虛擬篩選等理性設計最終獲得的突變酶徹底失去了原本利用NADPH的能力，但其催化活性卻只保留了野生型的14%[9]。

綜上所述，現有的關于輔酶特異性改造的研究已得到進一步的發展，但就現有的研究成果而言，采用理性設計的研究并不多，改造后酶的活性大多出現不同程度的損失，輔酶特異性發生一定的改變卻不能徹底改變等，這些方面都有較大的發展空間。

參考文獻：