[發明專利]干細胞在外源性神經營養因子作用下分化及鑒定的方法

有效

• 申請號: 201310724168.2
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103695374A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 陳茂華
• 申請（專利權）人: 溫州市中心醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/861;G01N33/68
• 代理公司: 溫州高翔專利事務所 33205
• 代理人: 朱德寶

技術領域

本發明涉及一種干細胞在外源性神經營養因子作用下分化及鑒定的方法，屬于醫學生物技術領域。?

背景技術

脊髓損傷是造成人體截癱的主要原因，一直是神經外科研究的重點和難點。脊髓損傷的病理生理過程包括脊髓原發性損傷、繼發性損害和脊髓修復三個階段。脊髓原發性損傷是受傷當時物理性損傷造成的神經細胞的死亡。脊髓繼發性損害的機制包括血液循環障礙、生化活性物質改變及能量代謝障礙等多個方面，其核心問題是組織的缺血缺氧。脊髓損傷后功能的喪失是由于神經細胞的死亡、上行和下行軸突的中斷以及缺乏有效的再生。最近的研究表明軸突再生的失敗是由于損傷部位存在阻礙軸突再生的疤痕組織及抑制性分子、被切斷的軸突缺乏營養支持和軸突被切斷后的內在性神經細胞改變包括細胞變性及死亡。脊髓損傷治療主要包括提供受損軸突生長允許性微環境、增強被切斷軸突的神經細胞的再生作用二大方面。過去所采用的方法包括脊髓內移植胚胎組織、外周神經、原代細胞、細胞系;以及應用營養因子、促使生長相關基因過度表達等。但是，單純應用一種方法并不能得到滿意的脊髓功能恢復，而聯合應用多種方法已經顯示出良好的脊髓功能恢復。

近來，從胚胎、成體腦和脊髓中分離出的神經干細胞引起了我們極大的興趣，包括胚胎干細胞、多能干細胞、祖細胞、定向祖細胞。自我更新和多種分化潛能是神經干細胞的二種基本屬性。?

發明內容

本發明提供了一種穩定的干細胞在外源性神經營養因子作用下分化及鑒定的方法。

為解決以上技術問題，本發明采用以下技術方案：干細胞在外源性神經營養因子作用下分化及鑒定的方法，包括有以下步驟：

（1）胚胎大鼠脊髓神經干細胞的分離和擴增

?嚴格無菌條件下，在DMEM細胞培養基中取出胚胎大鼠脊髓，用HBSS沖洗，剪碎，移入含DMEM/F12、EGF、FGF的全生長細胞培養基，用吸管吹打制成單細胞懸液，移入培養瓶；原代細胞克隆形成后再次機械分離制成單細胞懸液，每7-10天傳代一次，方法同前；低溫保存時，全生長細胞培養基中加入10%DMSO；在傳代同時并進行克隆形成實驗，用免疫細胞化學方法檢測Nestin、ECAM?確定細胞類型；

（2）依賴EGF和FGF的神經球細胞在不同外源性因子作用下的培養及分化

依賴EGF和FGF的神經球細胞轉移到12孔細胞培養板，在EGF或FGF和以下一種或數種因子聯合作用下培養4-8天：PDGF、NT-3、BDNF、NGF、EGF、FCS、FGF、順式視黃酸；免疫細胞化學方法檢測Nestin、ECAM?、NeuN確定細胞類型；

（3）含HIF-1α、BDNF序列的重組腺相關病毒的構建

?1）鼠HIF-1α的克隆：鼠肝癌細胞系Hepalclc7^提取?總RNA^RT-PCR?HIF-1αcDNA（核心序列約2.5Kb）^{酶切連接質粒}重組質粒—轉化細菌—篩選菌落，

?2）質粒pGEM-3zf(+)-GDNF由中科院分子免疫中心提供，轉化細菌—篩選菌落，

?3）目的基因的陽離子脂質體的包裝和測定，

?4）?表達載體的鑒定：酶切、瓊脂糖凝膠電泳及聚丙烯酰胺電泳分析HIF-1α、GDNF基因并驗證其表達的正確性；

（4）大鼠脊髓神經干細胞的體外轉染及分析：含目的基因的陽離子脂質體與培養的神經干細胞共同孵育1小時，然后置于含G418的細胞培養板培養24小時，收集新霉素抗性克隆；臺盤藍染色，至移植時，在HBSS中分離成單細胞懸液，重新放于全生長細胞培養基，確定細胞活性及密度為10⁵細胞/μl，移植后，剩余的細胞行組織化學法及免疫細胞化學法檢測類型等，并檢測β-gal與GDNF、HIF-1α表達的相關性；

（5）表達產物的測定和生物活性分析：采用Western?blot法和Slot?blot法驗證GDNF、HIF-1α的表達，應用E8雞胚DRG檢測GDNF的生物活性；采用Western?blot法、免疫組織化學法從蛋白質水平測定HIF-1α的生物活性。