[發明專利]干細胞在外源性神經營養因子作用下分化及鑒定的方法

有效

• 申請號: 201310724168.2
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103695374A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 陳茂華
• 申請（專利權）人: 溫州市中心醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/861;G01N33/68
• 代理公司: 溫州高翔專利事務所 33205
• 代理人: 朱德寶

1.干細胞在外源性神經營養因子作用下分化及鑒定的方法，包括有以下步驟：

（1）胚胎大鼠脊髓神經干細胞的分離和擴增

?嚴格無菌條件下，在DMEM細胞培養基中取出胚胎大鼠脊髓，用HBSS沖洗，剪碎，移入含DMEM/F12、EGF、FGF的全生長細胞培養基，用吸管吹打制成單細胞懸液，移入培養瓶；原代細胞克隆形成后再次機械分離制成單細胞懸液，每7-10天傳代一次，方法同前；低溫保存時，全生長細胞培養基中加入10%DMSO；在傳代同時并進行克隆形成實驗，用免疫細胞化學方法檢測Nestin、ECAM?確定細胞類型；

（2）依賴EGF和FGF的神經球細胞在不同外源性因子作用下的培養及分化

依賴EGF和FGF的神經球細胞轉移到12孔細胞培養板，在EGF或FGF和以下一種或數種因子聯合作用下培養4-8天：PDGF、NT-3、BDNF、NGF、EGF、FCS、FGF、順式視黃酸；免疫細胞化學方法檢測Nestin、ECAM?、NeuN確定細胞類型；

（3）含HIF-1α、BDNF序列的重組腺相關病毒的構建

?1）鼠HIF-1α的克隆：鼠肝癌細胞系Hepalclc7^提取?總RNA^RT-PCR?HIF-1αcDNA（核心序列約2.5Kb）^{酶切連接質粒}重組質粒—轉化細菌—篩選菌落，

?2）質粒pGEM-3zf(+)-GDNF由中科院分子免疫中心提供，轉化細菌—篩選菌落，

?3）目的基因的陽離子脂質體的包裝和測定，

?4）?表達載體的鑒定：酶切、瓊脂糖凝膠電泳及聚丙烯酰胺電泳分析HIF-1α、GDNF基因并驗證其表達的正確性；

（4）大鼠脊髓神經干細胞的體外轉染及分析：含目的基因的陽離子脂質體與培養的神經干細胞共同孵育1小時，然后置于含G418的細胞培養板培養24小時，收集新霉素抗性克隆；臺盤藍染色，至移植時，在HBSS中分離成單細胞懸液，重新放于全生長細胞培養基，確定細胞活性及密度為10⁵細胞/μl，移植后，剩余的細胞行組織化學法及免疫細胞化學法檢測類型等，并檢測β-gal與GDNF、HIF-1α表達的相關性；

（5）表達產物的測定和生物活性分析：采用Western?blot法和Slot?blot法驗證GDNF、HIF-1α的表達，應用E8雞胚DRG檢測GDNF的生物活性；采用Western?blot法、免疫組織化學法從蛋白質水平測定HIF-1α的生物活性。