[發明專利]一種用于近緣物種鑒別的PCR引物設計方法

有效

• 申請號: 201310723968.2
• 申請日: 2013-12-24
• 公開（公告）號: CN103646193A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 艾海新;劉宏生;張力;趙健
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: G06F19/20
• 分類號: G06F19/20;C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

技術領域

本發明涉及一種特異性引物的設計方法，尤其涉及一種用于鑒別近緣物種的PCR引物的設計方法。

背景技術

對于親緣關系接近的物種的鑒別一直是環境監測、水產品種類鑒別、動植物品種鑒別、病害診斷、進出口檢驗檢疫等領域的一項重要工作。而傳統的以形態學為基礎的分類鑒別方法具有很多缺陷，例如：多數近緣物種形態差異極小，難以鑒別；有些物種在不同生長時期或不同生長環境中形態差異較大，進一步增加了鑒別難度；作為原料加工后會失去其原有的形態特征，導致形態上難以區分；另外，參與鑒別的人員需要具有較深厚的形態分類學專業知識和經驗。這些缺陷對分類鑒別過程造成很大的困難，導致鑒別效率低、準確率低，不能適應快速鑒定、實際需求等問題。

隨著分子生物學技術的發展，以及越來越多物種基因組、rDNA、葉綠體基因、線粒體基因測序的完成，以DNA片段作為鑒別物種的分子標記的各類方法不斷發展出來。這些技術具有特異性強、準確率高、可重復性強、時間短等特點，已經廣泛應用于各類致病微生物、環境微生物、經濟作物等的分析鑒定中。而這些技術都依賴于一對或幾對針對特定種系（可以包括多個種、屬）高度特異性的PCR引物。

由于以下兩個原因導致設計這樣高度特異性的PCR引物存在困難：一、待鑒別的不同種系親緣關系接近，他們的基因序列也相似，因此引物必須設計在不同種系基因序列差異較大的位置，這種位置一般位于基因的高變區；二、為了保證引物可以檢測到待鑒別種系所有更小的分類單元或個體，引物需要設計在種系內基因差異較小的位置，而這種位置一般位于基因的保守區。對于親緣關系較近的不同種系，基因的保守區和高變區一般不會發生變化。因此設計出的引物會出現特異性差（引物位于保守區，不能有效區分兩個種系，出現假陽性）或敏感性差（引物位于高變區，只能鑒別種系內部分物種，出現假陰性）的問題。因此，設計出符合要求的PCR引物存在一定的難度。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于近緣物種鑒別的PCR引物設計方法，本發明解決了特異性引物設計中的技術問題，該方法能快速設計出高特異性高敏感性的用于鑒定某一種系生物的PCR引物，該引物也可以用于鑒別目的種系以及與目的種系親緣關系較近的種系。

本發明提供的一種用于近緣物種鑒別的PCR引物設計方法，方法包括以下步驟：

1)獲得近緣物種中，目標種系和非目標種系同一基因的序列，并進行多序列比對，獲得多序列比對文件。

2)以步驟1）中獲得的目標種系基因序列之一作為模板序列，確定模板序列中的高度保守區。

確定模板序列中的高度保守區，具體步驟如下：①統計多序列比對文件中每一位中堿基A、T、G、C和空位的百分比，確定模板序列的每個堿基在多序列比對文件中的保守性，以百分比表示；②設定保守性閾值為60%-80%，把模板序列分為保守區域和非保守區域；保守性大于60%-80%的定為保守區域；③在保守區域，對于堿基持續長度小于2×（最小引物長度﹣3’端不允許發生錯配區）的保守區域，重新劃分為非保守區域；④在保守區域，對于堿基持續長度大于或等于2×（最小引物長度﹣3’端不允許發生錯配區）的保守區域，在其兩端分別減去（最小引物長度﹣3’端不允許發生錯配區）長度的堿基，即為高度保守區；

所述的最小引物長度是堿基數為15-18bp，所述3’端不允許發生錯配區堿基數為0-6bp。

3）以步驟2）中作為模板序列的目標種系基因序列，排除步驟2）中確定的高度保守區，按照常規引物設計方法（可使用Primer3），設計出多個上游引物和多個下游引物，然后計算各引物的敏感性和特異性，排除敏感性和特異性低于設定的的敏感性閾值和特異性閾值（敏感性和特異性的閾值分別為0.5-0.9和0.5-0.9）的上游引物和下游引物。

各引物的敏感性和特異性的計算方法包括以下步驟：①根據單向引物在模板序列上的匹配位置，確定其在多序列比對文件中的每個序列上的結合位置，計算各上游引物和下游引物能否與多序列比對中各序列匹配，其計算方法包括以下步驟：如果引物與多序列比對中序列在3’端不允許發生錯配區（通常為3’端0-6bp）發生錯配，記為不匹配；如果引物與多序列比對中序列發生錯配的堿基數大于最大允許錯配堿基數（通常為0-6bp），記為不匹配；其余情況記為匹配；②對于所有引物計算其敏感性和特異性，引物的敏感性＝引物能匹配的目標種系基因序列的個數/目標種系基因序列的總個數；引物的特異性＝引物能匹配的目標種系基因序列的個數/引物能匹配的目標種系基因序列和非目標種系基因序列的總個數。