[發(fā)明專利]一種用于近緣物種鑒別的PCR引物設計方法

有效

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• 申請日: 2013-12-24
• 公開（公告）號: CN103646193A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設計）人: 艾海新;劉宏生;張力;趙健
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: G06F19/20
• 分類號: G06F19/20;C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 沈陽杰克知識產(chǎn)權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

1.一種用于近緣物種鑒別的PCR引物設計方法，其特征在于，方法包括以下步驟：

1）獲得近緣物種中，目標種系和非目標種系同一基因的序列，并進行多序列比對，獲得多序列比對文件；

2）以步驟1）中獲得的目標種系基因序列之一作為模板序列，確定模板序列中的高度保守區(qū)；

3）以步驟2）中作為模板序列的目標種系基因序列，排除步驟2）中確定的高度保守區(qū)，按照常規(guī)引物設計方法，設計出多個上游引物和多個下游引物，然后，計算各引物的敏感性和特異性，排除敏感性和特異性低于設定的敏感性閾值和特異性閾值的上游引物和下游引物；?

4）將剩余的上游引物和下游引物互相配對，產(chǎn)生引物對；然后，①?排除產(chǎn)物大小為負或產(chǎn)物長度范圍不在200-2000bp的引物對；②?計算各引物對的敏感性和特異性，排除敏感性和特異性低于設定的敏感性閾值和特異性閾值的引物對；③?排除不能通過常規(guī)引物設計軟件檢驗的引物對；

5）計算步驟4）中獲得的剩余引物對中每個引物對的P值，計算公式為：

P=(C!×D!×(A+B)!×(C+D-A-B)!)/(A!×B!×(C-A)!×(D-B)!×(C+D)!)；

其中，

A=引物能匹配的目標種系基因序列的個數(shù)；

B=引物能匹配的非目標種系基因序列的個數(shù)；

C=目標種系基因序列的總個數(shù)；

D=非目標種系基因序列的總個數(shù)；

然后對步驟4）中獲得的剩余引物對中的每個引物對進行聚類分析，把與模板序列結合位置相差小于10個堿基的引物對聚為一類，最后取出每類中P值最小的引物對作為用于近緣物種鑒別的PCR引物。

2.如權利要求1所述的一種用于近緣物種鑒別的PCR引物設計方法，其特征在于：步驟3）和步驟4）中所述的敏感性閾值是0.5-0.9，所述的特異性閾值是0.5-0.9。

3.如權利要求1所述的一種用于近緣物種鑒別的PCR引物設計方法，其特征在于：步驟2）確定模板序列中的高度保守區(qū)，具體步驟如下：①?統(tǒng)計多序列比對文件中每一位中堿基A、T、G、C和空位的百分比，確定模板序列的每個堿基在多序列比對文件中的保守性，以百分比表示；②?設定保守性閾值為60%-80%，把模板序列分為保守區(qū)域和非保守區(qū)域；保守性大于60%-80%的定為保守區(qū)域；③?在保守區(qū)域，對于堿基持續(xù)長度小于2×（最小引物長度﹣3’端不允許發(fā)生錯配區(qū)）的保守區(qū)域，重新劃分為非保守區(qū)域；④?在保守區(qū)域，對于堿基持續(xù)長度大于或等于2×（最小引物長度﹣3’端不允許發(fā)生錯配區(qū)）的保守區(qū)域，在其兩端分別減去（最小引物長度﹣3’端不允許發(fā)生錯配區(qū)）長度的堿基，即為高度保守區(qū)。

4.如權利要求3所述的一種用于近緣物種鑒別的PCR引物設計方法，其特征在于：所述的最小引物長度是堿基數(shù)為15-18bp，所述3’端不允許發(fā)生錯配區(qū)堿基數(shù)為0-6bp。

5.如權利要求1所述的一種用于近緣物種鑒別的PCR引物設計方法，其特征在于：步驟3）中各引物的敏感性和特異性的計算方法包括以下步驟：①?根據(jù)單向引物在模板序列上的匹配位置，確定其在多序列比對文件中的每個序列上的結合位置，計算各上游引物和下游引物能否與多序列比對中各序列匹配，其計算方法包括以下步驟：如果引物與多序列比對中的序列在3’端不允許發(fā)生錯配區(qū)發(fā)生錯配，記為不匹配；如果引物與多序列比對中的序列發(fā)生錯配的堿基數(shù)大于最大允許錯配堿基數(shù)0-6bp，記為不匹配；其余情況記為匹配；②?對于所有引物計算其敏感性和特異性，引物的敏感性＝引物能匹配的目標種系基因序列的個數(shù)/目標種系基因序列的總個數(shù)；引物的特異性＝引物能匹配的目標種系基因序列的個數(shù)/引物能匹配的目標種系基因序列和非目標種系基因序列的總個數(shù)。