[發(fā)明專利]一種破壞煙曲霉生物膜的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310720517.3
• 申請日: 2013-12-24
• 公開（公告）號: CN103698515A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設計）人: 陳一強;黃宏;孔晉亮
• 申請（專利權）人: 廣西醫(yī)科大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;A61K31/216;A61P31/10
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李珊

1.一種破壞煙曲霉生物膜的方法，包括制備藥物、收集菌株、制備載體、制備孢子懸液、藥物敏感試驗、制備煙曲霉生物膜載體、藥物對煙曲霉生物膜作用和結晶紫半定量，其特征在于，用金銀花提取物的綠原酸破壞煙曲霉生物膜，具體步驟如下：

1）制備藥物?取400~500mg綠原酸用3~6ml?100%的二甲亞砜溶解，配制成濃度為102400μg/ml的溶液，于-20℃~-25℃儲存；

2）收集菌株?收集煙曲霉菌株，質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌；

3）制備載體?將直徑為10~15?mm玻璃細胞爬片進行高溫高壓滅菌，作為載體；

4）制備孢子懸液?將步驟2）收集的菌株接種到PDA培養(yǎng)皿，置于35~37℃生化培養(yǎng)箱進行復蘇，后轉至另一個PDA培養(yǎng)皿并置于35~37℃生化培養(yǎng)箱活化3~5天后，用5~10ml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩沖液沖洗平皿表面收集孢子，用20~30ml?MOPS緩沖的RPMI-1640重懸孢子，用血細胞計數(shù)板調(diào)整孢子濃度，并用RPMI-1640液體培養(yǎng)液調(diào)整濃度為1~3×10⁶·孢子·ml^-1，再用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋50倍，得到2倍終濃度的孢子懸液；

5）藥物敏感試驗?微量液基稀釋法，在無菌的96孔細胞培養(yǎng)板的第1至第10孔加入步驟4）制備的孢子懸液，再將步驟1）制備的綠原酸置于無菌的96孔細胞培養(yǎng)板的第1至第10孔，第1孔加入量為100μl，第2~10孔依次倍比稀釋至二倍終濃度，第11孔為步驟4）制備孢子懸液的生長對照孔，第12孔為MOPS緩沖的RPMI-1640液體培養(yǎng)基，靜置于35~37℃培養(yǎng)48h，獲得綠原酸的最低抑菌濃度MIC；?

6）制備煙曲霉生物膜載體

A：早期模型建立?將步驟2）收集的菌株接種到PDA培養(yǎng)皿，置于35~37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)活化3~5天，用5~10ml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩沖液沖洗平皿表面收集孢子，用20~25ml?MOPS緩沖的RPMI-1640重懸孢子，用血細胞計數(shù)板調(diào)整孢子濃度，并用RPMI-1640液體培養(yǎng)液調(diào)整濃度為1~5×10⁵·孢子·ml^-1，將1~2ml孢子懸液放在步驟3）制備的載體上，靜置于35~37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24h時載體上為早期煙曲霉生物膜；

B：成熟期模型建立?將步驟A制備的煙曲霉生物膜培養(yǎng)48h時載體上為成熟期煙曲霉生物膜；

7）藥物對煙曲霉生物膜作用?將步驟6）制備的兩種模型煙曲霉生物膜載體用無菌磷酸鹽緩沖液漂洗，后放入新的無菌載體中，按步驟5）獲得的綠原酸最低抑菌濃度MIC，加入亞抑菌濃度的綠原酸，每個孔加入量為1ml，空白組為MOPS緩沖的RPMI?-1640液體培養(yǎng)基，靜置于35~37℃培養(yǎng)48~50h，后取出載體，進行結晶紫半定量；

8）結晶紫半定量??吸取步驟7）載體表面浮游菌液，室溫干燥，取1~2ml?1%結晶紫染色20~30min，用磷酸鹽緩沖液洗脫未結合的結晶紫，室溫干燥，用1~2ml?95%乙醇脫水3~5min，取100~110μl洗脫液于96孔酶標板中，在波長為570nm處測各孔酶標值。

2.根據(jù)權利要求1所述的破壞煙曲霉生物膜的方法，其特征在于，所述步驟7）藥物對煙曲霉生物膜作用，靜置培養(yǎng)48~50h過程中，間隔24h用與原孔中相同藥物換液。

3.根據(jù)權利要求1所述的破壞煙曲霉生物膜的方法，其特征在于，所述亞抑菌濃度的綠原酸濃度為128μg/ml~1024μg/ml。

4.根據(jù)權利要求1所述的破壞煙曲霉生物膜的方法，其特征在于，所述綠原酸為400~450mg。

5.根據(jù)權利要求1所述的破壞煙曲霉生物膜的方法，其特征在于，所述步驟5）加入藥物的量為100μl，靜置于35~36℃培養(yǎng)。