[發明專利]一種破壞煙曲霉生物膜的方法

有效

• 申請號: 201310720517.3
• 申請日: 2013-12-24
• 公開（公告）號: CN103698515A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 陳一強;黃宏;孔晉亮
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;A61K31/216;A61P31/10
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李珊

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及煙曲霉生物膜，具體涉及一種破壞煙曲霉生物膜的方法。

背景技術

生物膜是一種附著在組織的表面、由自身產生的胞外基質包圍的有結構的菌細胞群體，是相對于游離狀態的菌細胞而言的另一種微生物的生存方式。近年來研究發現，煙曲霉能在體內外形成生物膜，由于其菌絲被胞外基質所包裹，因此得以逃避抗真菌藥和機體免疫的傷害，從而能形成持續的感染源造成慢性而且耐藥的感染。由煙曲霉導致的侵襲性曲霉病是免疫低下患者主要的死亡原因之一，死亡率達到30~100%，目前治療侵襲性曲霉病的常用抗真菌藥物對煙曲霉生物膜效果欠佳，主要由于其胞外基質對煙曲霉菌絲細胞的保護，使得這些抗真菌藥的敏感性下降，研究報道顯示，生物膜中的煙曲霉菌比浮游菌耐藥性高幾十至上千倍，并且生物膜越成熟，胞外基質越致密，煙曲霉生物膜就會越耐藥。如果能夠破壞生物膜，使胞外基質減少甚至完全清除，使生物膜內的菌細胞失去胞外基質的保護而變成游離狀態的菌細胞，那么這些菌的耐藥性將會減低，目前尚未發現能破壞煙曲霉生物膜的藥物，因此治療煙曲霉生物膜相關感染成為臨床難題。

發明內容

本發明提供一種破壞煙曲霉生物膜的方法，包括制備藥物、收集菌株、制備載體、制備孢子懸液、藥物敏感試驗、制備煙曲霉生物膜載體、藥物對煙曲霉生物膜作用和結晶紫半定量，其特征在于，用金銀花提取物的綠原酸破壞煙曲霉生物膜，具體步驟如下：

1）制備藥物?取400~500mg綠原酸用3~6ml?100%的二甲亞砜溶解，配制成濃度為102400μg/ml的溶液，于-20℃~-25℃儲存；

2）收集菌株?收集煙曲霉菌株，質控菌株為ATCC22019近平滑念珠菌；

3）制備載體?將直徑為10~15?mm玻璃細胞爬片進行高溫高壓滅菌，作為載體；

4）制備孢子懸液?將步驟2）收集的菌株接種到PDA培養皿，置于35~37℃生化培養箱進行復蘇，后轉至另一個PDA培養皿并置于35~37℃生化培養箱活化3~5天后，用5~10ml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩沖液沖洗平皿表面收集孢子，用20~30ml?MOPS緩沖的RPMI-1640重懸孢子，用血細胞計數板調整孢子濃度，并用RPMI-1640液體培養液調整濃度為1~3×10⁶·孢子·ml^-1，再用RPMI-1640液體培養基稀釋50倍，得到2倍終濃度的孢子懸液；

5）藥物敏感試驗?微量液基稀釋法，在無菌的96孔細胞培養板的第1至第10孔加入步驟4）制備的孢子懸液，再將步驟1）制備的綠原酸置于無菌的96孔細胞培養板的第1至第10孔，第1孔加入量為100μl，第2~10孔依次倍比稀釋至二倍終濃度，第11孔為步驟4）制備孢子懸液的生長對照孔，第12孔為MOPS緩沖的RPMI-1640液體培養基，靜置于35~37℃培養48h，獲得綠原酸的最低抑菌濃度MIC；最低抑菌濃度（MIC）的判定：肉眼觀察判斷終點，96培養板各個孔充分混勻之后與生長對照孔比較，100%生長抑制所對應的最低藥物濃度為此藥物的MIC；

6）制備煙曲霉生物膜載體

A：早期模型建立?將步驟2）收集的菌株接種到PDA培養皿，置于35~37℃培養箱培養活化3~5天，用5~10ml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩沖液沖洗平皿表面收集孢子，用20~25ml?MOPS緩沖的RPMI-1640重懸孢子，用血細胞計數板調整孢子濃度，并用RPMI-1640液體培養液調整濃度為1~5×10⁵·孢子·ml^-1，將1~2ml孢子懸液放在步驟3）制備的載體上，靜置于35~37℃生化培養箱中培養；培養24h時載體上為早期煙曲霉生物膜；

B：成熟期模型建立?將步驟A制備的煙曲霉生物膜培養48h時載體上為成熟期煙曲霉生物膜；

7）藥物對煙曲霉生物膜作用?將步驟6）制備的兩種模型煙曲霉生物膜載體用無菌磷酸鹽緩沖液漂洗，后放入新的無菌載體中，按步驟5）獲得的綠原酸最低抑菌濃度MIC，加入亞抑菌濃度的綠原酸，每個孔加入量為1ml，空白組為MOPS緩沖的RPMI?-1640液體培養基，靜置于35~37℃培養48~50h，后取出載體，進行結晶紫半定量；

8）結晶紫半定量??吸取步驟7）載體表面浮游菌液，室溫干燥，取1~2ml?1%結晶紫染色20~30min，用磷酸鹽緩沖液洗脫未結合的結晶紫，室溫干燥，用1~2ml?95%乙醇脫水3~5min，取100~110μl洗脫液于96孔酶標板中，在波長為570nm處測各孔酶標值。