[發明專利]一種生物轉化紅棗單糖開發含阿洛酮糖功能性棗汁的技術

在審

• 申請號: 201310720292.1
• 申請日: 2013-12-24
• 公開（公告）號: CN103789377A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 王曉艷;門燕;馮俊敏;孫媛霞;張佩舜;朱玥明;康振奎;鞏晉龍;鄭麗萍;王小鵬;李奠礎
• 申請（專利權）人: 山西天驕食業有限公司;中國科學院天津工業生物技術研究所;山西天驕生物集團有限公司
• 主分類號: C12P19/24
• 分類號: C12P19/24;C12P19/02;C12N11/18;C12N9/92;C12N9/90;C12N15/70;C12R1/19;C12R1/07;C12R1/01
• 代理公司: 太原高欣科創專利代理事務所(普通合伙) 14109
• 代理人: 崔雪花

技術領域

本發明涉及雙酶共表達技術及雙酶偶聯與固定化技術，具體涉及一種定點突變葡萄糖異構酶和D-阿洛酮糖3-差向異構酶共表達制備方法以及該雙酶的偶聯與固定化技術以及偶聯固定雙酶在紅棗濃縮汁生產阿洛酮糖中的應用。

背景技術

紅棗集營養、保健、藥用功能于一體，列入衛生部第一批藥食兼用果品。紅棗富含糖類物質，含糖量居各類果品之首，比制糖原料甘蔗、甜菜還高。鮮棗含糖量達20%-36%，干棗含糖量高達50-80%，棗中的糖類可分為以下三類：單糖（主要是葡萄糖和果糖）、雙糖和多糖，其中果糖含量占43.95%、葡萄糖占42.32%、蔗糖占3.85%、低聚糖及多糖占9.86%。

我國紅棗糖質資源豐富，紅棗濃縮汁中富含葡萄糖以及果糖等原料。然而果糖與葡萄糖都是高能量物質，攝入會給機體帶來巨大的生理壓力，導致肥胖人群比例不斷增大，糖尿病和心血管疾病人群逐年增加，并呈現出低齡化趨勢。盡管沒有顯著證據證明肥胖與糖尿病和心血管疾病直接相關，但控制能量攝入對促進健康、減少脂肪積累，降低糖尿病和心血管疾病等慢性病的發生的作用已經得到公認。含有較高能量的高糖食品逐漸淡出貨架，低熱量、具有更多功能營養特性的功能食品在市場中受到歡迎。

D-阿洛酮糖是D-果糖的差向異構體，且在甜味強度和種類方面與D-果糖非常相似。然而，與D-果糖不同，D-阿洛酮糖在體內同化作用過程中很難代謝，且具有較低程度的熱量供給。因此，D-阿洛酮糖能用作膳食的有效成分。當前廣泛用作非糖甜味劑的糖醇在多于規定劑量攝取時會引起副作用，如腹瀉，而D-阿洛酮糖沒有這樣的副作用，而且D-阿洛酮糖具有通過抑制脂肪生成酶的活性而減少腹部脂肪的功能。因此，D-阿洛酮糖能夠用作甜味劑，該甜味劑還對有助于重量減輕。就此而論，D-阿洛酮糖作為飲食的甜味劑吸引了大量的興趣，并且在食品工業中存在著的對開發高效生產D-阿洛酮糖的方法增加的需要。這是因為D-阿洛酮糖僅作為在theriae處理或葡萄糖異構化反應過程中的中間體，非常少量地存在于在自然界中，且不能化學合成。

木糖異構酶(xylose?isomerase，Xiase，EC?5.3.1.5)，又稱葡萄糖異構酶(glucose?isomerase，GIase)，在胞外可以催化D-葡萄糖至D-果糖的異構化反應，是食品工業生產上以淀粉為原料制備果葡糖漿的關鍵酶之一。

D-阿洛酮糖3-差向異構酶（D-psicose?3-epimerase，縮寫為DPE）是目前能實現D-果糖到D-阿洛酮糖之間生物轉化的一種主要酶，屬于酮糖3-差向異構酶家族，最適底物為D-阿洛酮糖。因此，應用基因工程技術制備葡萄糖異構酶和D-阿洛酮糖3-差向異構酶的重組酶，可以有效地將D-葡萄糖轉化為D-果糖、再由D-果糖轉化為D-阿洛酮糖。

單酶體系應用中存在著對環境敏感、性質不穩定易失活，產物難分離提純的問題。固定化酶技術不僅能節約酶的成本，提高酶的使用穩定性，簡化后續分離步驟，更可以通過將幾種酶進行聯合固定化以實現多酶體系的協同反應，在反應過程中減小酶與底物的作用范圍，增大酶周圍的反應物濃度，提高反應的效率。隨著多酶體系的研究應用，多酶體系共固定和共反應已成為一個活躍的研究領域，是酶工程領域的前沿之一。

多酶體系的固定化可分為建立在單酶固定化基礎上的混合固定化酶技術和新發展起來的多酶共固定化技術。混合固定化酶是將單酶分別固定到不同載體上在同一反應體系中混合，但由于這種酶固定在不同載體上，反應中物質傳遞要克服兩重擴散屏障，使酶促反應受到限制，需要進一步改善載體傳質性能。

多酶共固定化是指將多種酶固定在同一載體上，能將不同酶的特點充分發揮并相互結合起來，排除測定物中的干擾因素，從而利用酶的協同效應使催化效率高于單一固定化酶。多酶共固定化技術的應用還解決了混合固定化中多酶間的傳質問題，通過減小傳質距離縮短了底物的轉運時間，同時提高了多酶體系的效率和使用周期，更加有利于產物的分離提取，從各方面降低了生產的成本。隨著固定化技術的深入研究，大量新型的綜合性固定化載體及簡便的固定化方法得到廣泛應用，這將使多酶偶聯反應體系在工業化生產中發揮更大的作用。