[發(fā)明專利]一種生物轉(zhuǎn)化紅棗單糖開發(fā)含阿洛酮糖功能性棗汁的技術(shù)

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310720292.1
• 申請(qǐng)日: 2013-12-24
• 公開（公告）號(hào): CN103789377A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王曉艷;門燕;馮俊敏;孫媛霞;張佩舜;朱玥明;康振奎;鞏晉龍;鄭麗萍;王小鵬;李奠礎(chǔ)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山西天驕?zhǔn)硺I(yè)有限公司;中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所;山西天驕生物集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/24
• 分類號(hào): C12P19/24;C12P19/02;C12N11/18;C12N9/92;C12N9/90;C12N15/70;C12R1/19;C12R1/07;C12R1/01
• 代理公司: 太原高欣科創(chuàng)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 14109
• 代理人: 崔雪花

1.一種生物轉(zhuǎn)化紅棗單糖開發(fā)含阿洛酮糖功能性棗汁的技術(shù)，其特征在于按照以下步驟進(jìn)行：

第一步，獲得目的基因

將葡萄糖異構(gòu)酶氨基酸序列的146位的精氨酸定點(diǎn)突變?yōu)楦彼幔缓髮⑼蛔兒蟮钠咸烟钱悩?gòu)酶的核苷酸序列與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將擴(kuò)增后的所述定點(diǎn)突變的葡萄糖異構(gòu)酶的核苷酸序列與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列分別純化后，分別克隆所述定點(diǎn)突變的葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列；

第二步，重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將上述得到的定點(diǎn)突變的葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列及pCDFDuet-1載體分別用Bam?HI和Kpn?I進(jìn)行雙酶切，將D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列與pCDFDuet-1載體分別用Bgl?II和Hind?III進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用T₄連接酶于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli?DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鏈霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，分別用PCR和雙酶切法進(jìn)行鑒定，并挑取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序；產(chǎn)物再將陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌中誘導(dǎo)表達(dá)得到重組菌；

第三步，將重組菌經(jīng)離心收集，并超聲破碎，再次離心即得到定點(diǎn)突變的葡萄糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶共表達(dá)的粗酶液；

第四步，固定化

將得到的粗酶液加入樹脂中，每1.0g樹脂加酶量：0.5~2ml基因重組制備的粗酶液，吸附溫度為25℃~35℃，吸附pH=6.5~7.5，吸附時(shí)間100~140min，然后加入交聯(lián)劑，交聯(lián)25~35min得到固定化酶，所述交聯(lián)劑體積份數(shù)為0.03%~0.06%；

第五步，催化紅棗汁生產(chǎn)阿洛酮糖

將紅棗汁加入所述固定化酶中，控制溫度：60~70℃；pH值：5.0~7.0；所述紅棗汁與固定化酶的重量份比為1~5:1；5~10小時(shí)候完成催化反應(yīng)，得到D-阿洛酮糖混合液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物轉(zhuǎn)化紅棗單糖開發(fā)含阿洛酮糖功能性棗汁的技術(shù)，其特征在于所述第一步中定點(diǎn)突變的步驟為：

以pET-28a-GI為模板，設(shè)計(jì)完全互補(bǔ)配對(duì)的上、下游突變引物；按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：95℃?3?min；94?℃?30s，60℃?30?s，68℃?6min，共16個(gè)循環(huán)；68℃?10min；PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化后，轉(zhuǎn)化E.coli?DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含10%卡那霉素的LB平板；挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并測(cè)序，若測(cè)序發(fā)現(xiàn)未正確突變，則重新挑取單菌落測(cè)序或重新突變后測(cè)序，直至突變成功；

所述上、下游突變引物為：

F-AACTTATTTACCCATCCTCGCTTTGTCCATGGC

R-GCCATGGACAAAGCGAGGATGGGTAAATAAGTT。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物轉(zhuǎn)化紅棗單糖開發(fā)含阿洛酮糖功能性棗汁的技術(shù)，其特征在于所述第一步定點(diǎn)突變后的葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列與D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增的條件為：

突變葡萄糖異構(gòu)酶核苷酸序列引物：

上游引物：5′-GAAGATCTCATGCCTTATTTTGACAACATCAGCA-3′

下游引物：5′-GGGGTACCTTAACGGGCTGCGCAAACTT-3′

D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶核苷酸序列引物：

上游引物：5′-CGGGATCCGATGAAATATGGTATTTATTACGCT-3′

下游引物：5′-CCCAAGCTTGACTTCAAATACATGTTTTACA-3′

PCR反應(yīng)體系（50μL）為10×Taq緩沖溶液5μL，模板DNA1μL，濃度為10μmol·L^-1的引物2μL，濃度為2.5mmol·L^-1的dNTPs?4μL，TaqDNA聚合酶0.3μL，超純水35.7μL，混勻；反應(yīng)條件：95℃?5min；94℃?45s，53℃?45s，72℃?2min，32個(gè)循環(huán)；72℃?10min。