[發明專利]一種生物轉化紅棗單糖開發含阿洛酮糖功能性棗汁的技術

在審

• 申請號: 201310720292.1
• 申請日: 2013-12-24
• 公開（公告）號: CN103789377A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 王曉艷;門燕;馮俊敏;孫媛霞;張佩舜;朱玥明;康振奎;鞏晉龍;鄭麗萍;王小鵬;李奠礎
• 申請（專利權）人: 山西天驕食業有限公司;中國科學院天津工業生物技術研究所;山西天驕生物集團有限公司
• 主分類號: C12P19/24
• 分類號: C12P19/24;C12P19/02;C12N11/18;C12N9/92;C12N9/90;C12N15/70;C12R1/19;C12R1/07;C12R1/01
• 代理公司: 太原高欣科創專利代理事務所(普通合伙) 14109
• 代理人: 崔雪花

1.一種生物轉化紅棗單糖開發含阿洛酮糖功能性棗汁的技術，其特征在于按照以下步驟進行：

第一步，獲得目的基因

將葡萄糖異構酶氨基酸序列的146位的精氨酸定點突變為脯氨酸，然后將突變后的葡萄糖異構酶的核苷酸序列與D-阿洛酮糖3-差向異構酶核苷酸序列分別進行PCR擴增；將擴增后的所述定點突變的葡萄糖異構酶的核苷酸序列與D-阿洛酮糖3-差向異構酶核苷酸序列分別純化后，分別克隆所述定點突變的葡萄糖異構酶核苷酸序列和D-阿洛酮糖3-差向異構酶核苷酸序列；

第二步，重組表達質粒的構建

將上述得到的定點突變的葡萄糖異構酶核苷酸序列及pCDFDuet-1載體分別用Bam?HI和Kpn?I進行雙酶切，將D-阿洛酮糖3-差向異構酶核苷酸序列與pCDFDuet-1載體分別用Bgl?II和Hind?III進行雙酶切，酶切產物經純化回收后，用T₄連接酶于16℃連接過夜，轉化E.coli?DH5α感受態細胞，鏈霉素抗性平板篩選轉化子，分別用PCR和雙酶切法進行鑒定，并挑取陽性轉化子進行測序；產物再將陽性轉化子的質粒轉入宿主菌中誘導表達得到重組菌；

第三步，將重組菌經離心收集，并超聲破碎，再次離心即得到定點突變的葡萄糖異構酶和D-阿洛酮糖3-差向異構酶共表達的粗酶液；

第四步，固定化

將得到的粗酶液加入樹脂中，每1.0g樹脂加酶量：0.5~2ml基因重組制備的粗酶液，吸附溫度為25℃~35℃，吸附pH=6.5~7.5，吸附時間100~140min，然后加入交聯劑，交聯25~35min得到固定化酶，所述交聯劑體積份數為0.03%~0.06%；

第五步，催化紅棗汁生產阿洛酮糖

將紅棗汁加入所述固定化酶中，控制溫度：60~70℃；pH值：5.0~7.0；所述紅棗汁與固定化酶的重量份比為1~5:1；5~10小時候完成催化反應，得到D-阿洛酮糖混合液。

2.根據權利要求1所述的一種生物轉化紅棗單糖開發含阿洛酮糖功能性棗汁的技術，其特征在于所述第一步中定點突變的步驟為：

以pET-28a-GI為模板，設計完全互補配對的上、下游突變引物；按以下程序進行PCR反應：95℃?3?min；94?℃?30s，60℃?30?s，68℃?6min，共16個循環；68℃?10min；PCR產物經DpnI消化后，轉化E.coli?DH5α感受態細胞，涂布于含10%卡那霉素的LB平板；挑取轉化子培養并測序，若測序發現未正確突變，則重新挑取單菌落測序或重新突變后測序，直至突變成功；

所述上、下游突變引物為：

F-AACTTATTTACCCATCCTCGCTTTGTCCATGGC

R-GCCATGGACAAAGCGAGGATGGGTAAATAAGTT。

3.根據權利要求1所述的一種生物轉化紅棗單糖開發含阿洛酮糖功能性棗汁的技術，其特征在于所述第一步定點突變后的葡萄糖異構酶核苷酸序列與D-阿洛酮糖3-差向異構酶核苷酸序列進行PCR擴增的條件為：

突變葡萄糖異構酶核苷酸序列引物：

上游引物：5′-GAAGATCTCATGCCTTATTTTGACAACATCAGCA-3′

下游引物：5′-GGGGTACCTTAACGGGCTGCGCAAACTT-3′

D-阿洛酮糖3-差向異構酶核苷酸序列引物：

上游引物：5′-CGGGATCCGATGAAATATGGTATTTATTACGCT-3′

下游引物：5′-CCCAAGCTTGACTTCAAATACATGTTTTACA-3′

PCR反應體系（50μL）為10×Taq緩沖溶液5μL，模板DNA1μL，濃度為10μmol·L^-1的引物2μL，濃度為2.5mmol·L^-1的dNTPs?4μL，TaqDNA聚合酶0.3μL，超純水35.7μL，混勻；反應條件：95℃?5min；94℃?45s，53℃?45s，72℃?2min，32個循環；72℃?10min。