[發(fā)明專利]檢測(cè)ASXL1基因c.1934dupG突變位點(diǎn)的方法和引物

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310720112.X
• 申請(qǐng)日: 2013-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN103757103A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李文靜;陳奕磊;王淑一
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都艾迪康醫(yī)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測(cè)ASXL1基因c.1934dupG突變位點(diǎn)的方法和引物。

背景技術(shù)

急性髓性白血病(AML）是由于髓系造血干／祖細(xì)胞發(fā)生累積的獲得性基因改變,導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化和凋亡途徑發(fā)生變化的一種惡性血液疾病。

ASXL1基因編碼染色體連接蛋白polycomb家族的一個(gè)成員，并且與后天的基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)。ASXL1基因所編碼的蛋白包含了與植物同源的區(qū)域和細(xì)胞核受體盒區(qū)域，并且能夠作為配體依賴的視黃酸受體共活化物發(fā)揮作用。已證實(shí)該蛋白能夠通過(guò)由NCOA1基因編碼的具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白或由LSD1基因編碼的組蛋白去甲基化酶發(fā)揮直接作用。與TET2基因突變不同的是，ASXL1突變與其它繼發(fā)的遺傳性異常互相排斥。就ASX1突變而言，骨髓增生異常綜合征（MDS）和骨髓增殖性腫瘤（MPN）患者的突變發(fā)生率為10%，AML患者的突變發(fā)生率為17%，而慢性骨髓單核細(xì)胞性白血病（CMML）患者的突變發(fā)生率大于40%。ASXL1突變?cè)贛DS患者中是頻繁發(fā)生的分子畸變，預(yù)示患者預(yù)后不良。對(duì)AML患者進(jìn)行ASXL1突變篩查可能有助于進(jìn)行臨床危險(xiǎn)分級(jí)和制定治療方案。

在MPN中，ASXL1基因的絕大多數(shù)突變發(fā)生在第12外顯子，其他外顯子的突變較少見(jiàn)。最常見(jiàn)的ASXL1基因突變是c.1934dupG位點(diǎn)突變，在所有ASXL1基因突變當(dāng)中，它所占的比例為50％以上，該突變?yōu)橐粋€(gè)鳥嘌呤核苷酸（c.1934dupG）的重復(fù)，它會(huì)導(dǎo)致移碼（Gly646TrpfsX12）。

目前檢測(cè)ASXL1基因c.1934dupG突變位點(diǎn)的方法有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（SSCP）,基因測(cè)序，熒光定量PCR等，SSCP技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，但酶切位點(diǎn)易受基因變異影響，影響結(jié)果判斷，由于方法本身的技術(shù)限制，檢測(cè)靈敏度低。由于檢測(cè)單堿基突變，采用熒光定量PCR的SYBR?Green染料法檢測(cè)基因突變存在引物特異性差的問(wèn)題，檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性率很高。要達(dá)到高特異性的要求，熒光定量PCR（探針?lè)ǎ┑臋z測(cè)方法就需要設(shè)計(jì)一對(duì)引物和兩條MGB探針，其中一條探針檢測(cè)ASXL1基因野生型位點(diǎn)，另一條探針檢測(cè)ASXL1基因c.1934dupG突變位點(diǎn)，而且還需要使用與之相配套的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，檢測(cè)成本比較高，給臨床應(yīng)用帶來(lái)了不便。

考慮到靈敏度、提高檢測(cè)特異性和節(jié)約成本等因素，本發(fā)明設(shè)計(jì)了擴(kuò)增ASXL1基因c.1934dupG突變位點(diǎn)的正、反向擴(kuò)增引物，并利用這對(duì)擴(kuò)增引物對(duì)送檢樣本進(jìn)行Touch-down?PCR擴(kuò)增，讓PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后變性，隨后利用一對(duì)測(cè)序引物直接進(jìn)行Sanger測(cè)序，就可以準(zhǔn)確和特異性地檢測(cè)ASXL1基因c.1934dupG突變位點(diǎn)。其中，Touch-down?PCR(也被稱作降落PCR)是指每一個(gè)（或n個(gè)）循環(huán)退火溫度逐步降低0.5至1℃，直到達(dá)到一個(gè)較低的退火溫度，然后在該溫度下繼續(xù)循環(huán)10至20次左右。Touch-down?PCR擴(kuò)增可確保正、反向擴(kuò)增引物與樣品DNA模板的結(jié)合發(fā)生在最互補(bǔ)的序列之間，當(dāng)退火溫度降低到非特異性擴(kuò)增發(fā)生的水平時(shí)，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物在此時(shí)已經(jīng)有一個(gè)幾何數(shù)的起始優(yōu)勢(shì)，豐度較高，在剩余的擴(kuò)增反應(yīng)中，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物與非特異擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，但是因非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物豐度較低，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物始終優(yōu)先擴(kuò)增，從而產(chǎn)生單一的占主導(dǎo)地位的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。特別地，本領(lǐng)域技術(shù)人員不能保證每次提取出的樣品DNA模板純度非常高，而且即便所提取出的樣品DNA模板純度足夠高，但是該DNA模板可能存在多個(gè)與目的基因同源性較高的序列，因此采用Touch-down?PCR就可確保正、反向引物最大限度地與目的基因序列結(jié)合，從而提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供用于檢測(cè)ASXL1基因c.1934dupG突變位點(diǎn)的引物，所述引物包括：擴(kuò)增ASXL1基因c.1934dupG突變位點(diǎn)的正、反向擴(kuò)增引物，其堿基序列為：

ASXL1-exon12-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT

ASXL1-exon12-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。

進(jìn)一步地，所述引物還包括一對(duì)測(cè)序引物，其堿基序列為：

ASXL1-exon12-S-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT

ASXL1-exon12-S-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。

進(jìn)一步地，所述正、反向引物的使用濃度比為：ASXL1-exon12-F:ASXL1-exon12-R-R=1:1。