[發明專利]一種熱穩定性好的β?葡聚糖酶的制備方法

有效

• 申請號: 201310717215.0
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103820419B
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 李洪兵;張錦杰;劉文明;劉波;封章平;王永蘭
• 申請（專利權）人: 湖南鴻鷹生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12R1/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于酶制劑制備技術領域，特別是一種高產熱穩定性好的β-葡聚糖酶的地衣芽孢桿菌。

背景技術

β-葡聚糖是一種天然多糖，通常存在于特殊種類的細菌、酵母菌及真菌的細胞壁，或者高等植物種子的包被中。β-葡聚糖是構禾本植物細胞壁的一種結構性非淀粉多糖，在大麥、黑麥、高粱、大米及小米的胚乳細胞壁中含量尤其高。與一般糖類主要以α-1，4-糖苷鍵結合而成為線形分子不同的是，植物細胞壁中的β-葡聚糖是以混合的β-（1,3），（1,4）糖苷鍵連接形成的D型葡萄糖聚合物，因此β-葡聚糖可以以很大的分子量溶解于水中，從而具有粘度大、親水性高、吸水膨脹力和持水性高的性質。當以大麥作為啤酒生產原料時，上述性質便會影響麥芽汁的過濾速度，降低固形物的浸出率，還會因凝膠沉淀作用而降低啤酒的品質；同時當含有β-葡聚糖的作物用作飼料時，會增加非反芻禽畜的腸液粘度，成為飼料的抗營養因子之一，降低飼料的利用率。

β-葡聚糖酶是高效、專一分解β-葡聚糖的主要酶，在啤酒和飼料的生產過程中添加該酶能有效的解決上述問題。在飼料工業中它能水解β-葡聚糖中的1-3或1-4糖苷鍵，使之降解為低分子糖，降解后的β-葡聚糖市區親屬性和粘性，不會在畜禽腸道中膨脹粘連，使得食糜的消化率以及飼料的能量利用率均得到提高。β-葡聚糖酶應用于啤酒生產中，可以轉移分解粘度很高的各種大麥β-葡聚糖，疏松大麥胚乳細胞壁，促進細胞內容物的外溢，提高原料利用率，降低麥芽汁粘度，從而使啤酒產量增加，品質得以提升。

目前，美國、日本、丹麥、德國、澳大利亞、加拿大等國均已采用β-葡聚糖酶作為啤酒和飼料工業的主要酶制劑，而其在醫藥、紡織、廢水處理和日用化工、生物防治等其他方面的應用價值也逐漸顯現出來，前景十分廣闊。但是熱穩定性差和酶活力低已經成為影響其應用效果的制約因素。

中國專利CN103013873A公開了一株產熱穩定性β-葡聚糖酶的菌株，該發明首次提供了一株來源于溫泉的能夠生產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高地芽孢桿菌，并克隆得到了該酶的基因，該酶在60℃條件下保存1h后仍能保持90%的酶活力。

中國專利CN102719416A提供了一種提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶熱穩定性的方法，通過HNO₂對β-1,3-1,4-葡聚糖酶進行化學修飾，所得的β-1,3-1,4-葡聚糖酶T₅₀值和t_{（1/2,60℃）}分別提高了4.76%和62.1%。

之前，市場上高品質的β-葡聚糖酶幾乎被國外的酶制劑生產公司所壟斷，雖然近幾年我國所報道的微生物產β-葡聚糖酶的酶活力已達到甚至超過了國際水平，但是能夠獲得兼具高活性及熱穩定性的β-葡聚糖酶及其生產菌株仍然是目前工業應用中亟待解決的一大問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種熱穩定性好的β-葡聚糖酶的制備方法。

本發明提供的產熱穩定性好的β-葡聚糖酶的菌株具體為地衣芽孢桿菌（Βacillus licheniformis）β-10-25。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC，地址為：湖北省武漢市武昌區珞珈山武漢大學生命科學學院），保藏號為CCTCC NO：M2013538。

所述地衣芽孢桿菌（Βacillus licheniformis）β-10-25特點如下：

所述菌株在固體平板上菌落為白色，邊緣不整齊，表面干燥不透明，鏡檢為革蘭氏陽性細菌，細胞形態呈短桿狀，芽孢中生，橢圓形，不膨大。

所述菌株生理生化特征：V-P試驗（+），淀粉水解（+），酪素水解（+），明膠水解（+），硝酸鹽還原（+），吲哚試驗（-），利用檸檬酸鹽（+），硝酸還原（+），甘露醇（+），木糖（+）。

一種熱穩定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，包括如下步驟：

（1）種子培養

將β-10-25斜面菌種經三級搖瓶發酵劑一級種子罐發酵；

所述種子培養的培養基為：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl1％，pH4.5-7.0，121-123℃滅菌30-40min。

（2）發酵罐發酵