[發(fā)明專利]一種熱穩(wěn)定性好的β?葡聚糖酶的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310717215.0
• 申請(qǐng)日: 2013-12-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103820419B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李洪兵;張錦杰;劉文明;劉波;封章平;王永蘭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南鴻鷹生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/24
• 分類號(hào): C12N9/24;C12R1/10
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1.一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶由地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)β-10-25通過(guò)發(fā)酵法制得，菌種保藏號(hào)為CCTCC NO:M2013538。

2.如權(quán)利要求1所述一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，包括如下步驟：地衣芽孢桿菌CCTCC NO:M2013538的斜面菌種活化培養(yǎng)獲得液體種子；將一級(jí)種子罐發(fā)酵液以3％接種量接入含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度35-45℃，攪拌速度200-300r/min，通風(fēng)量V/V 1:1-3,培養(yǎng)時(shí)間10-15h；然后將1L經(jīng)過(guò)121℃滅菌20min，溫度為10℃的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)入發(fā)酵罐，待溫度升至35-45℃時(shí)恒溫培養(yǎng)15-20h；此時(shí)，將一級(jí)種子罐發(fā)酵液以2％接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)10-15h；繼續(xù)將1L經(jīng)過(guò)121℃滅菌20min，溫度為10℃的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)入發(fā)酵罐，待溫度升至35-45℃時(shí)恒溫培養(yǎng)10-15h；

發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、精濾、干燥得β-葡聚糖酶。

3.如權(quán)利要求2所述的一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，其特征在于，種子培養(yǎng)基組成為：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％，pH4.5-7.0。

4.如權(quán)利要求2所述的一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含：麥芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆餅粉15-25g，中草藥粉劑30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿1-5g，硫酸銨1-3g，磷酸氫二鉀1-2g，磷酸二氫鉀1-2g，檸檬酸鈉1-5g，消泡劑0.1-1g,純凈水l000mL，pH值4.5-7；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調(diào)配方法為：按比例準(zhǔn)確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調(diào)節(jié)PH值4.5-7，加入3u中溫淀粉酶/g玉米粉與30u高溫淀粉酶/g玉米粉，同時(shí)邊攪拌邊升溫至70℃保溫15-30min，然后緩慢升溫至90℃保溫15-30min進(jìn)行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，pH4.5-7，備用。

5.如權(quán)利要求4所述的一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述中草藥粉劑的制備方法如下：

稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；麥冬10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70℃～90℃保持2～4h，然后降溫至45-60℃，加入混合物料總重量5-10％的混合酶進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，混合物中乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1：1-1.5，110W超聲萃取0.5～1.5h，過(guò)濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。

6.如權(quán)利要求5所述的一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述混合酶的重量份數(shù)組成為：β-葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，果膠酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，木瓜蛋白酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。

7.如權(quán)利要求2所述的一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制備方法，包括如下步驟：

(1)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)

①一級(jí)種子培養(yǎng)：將活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度40℃，培養(yǎng)時(shí)間10h；

②二級(jí)種子培養(yǎng)：將一級(jí)種子按照10％的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級(jí)種子培養(yǎng)相同；

③三級(jí)種子培養(yǎng)：將二級(jí)種子以10％接種量接入5000毫升三級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度40℃，培養(yǎng)時(shí)間12h；

④一級(jí)種子罐培養(yǎng)：將三級(jí)種子以10％接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度41℃，攪拌速度300rpm，通風(fēng)量V/V 1:1.5,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時(shí)間15h；

種子培養(yǎng)基組成為：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％，pH5.5，121℃滅菌35min；

(2)發(fā)酵罐發(fā)酵

將一級(jí)種子罐發(fā)酵液以3％接種量接入含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度37℃，攪拌速度250r/min，通風(fēng)量V/V 1:1-3,培養(yǎng)時(shí)間12h；然后將1L經(jīng)過(guò)121℃滅菌20min，溫度為10℃的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)入發(fā)酵罐，待溫度升至37℃時(shí)恒溫培養(yǎng)18h；此時(shí)，將一級(jí)種子罐發(fā)酵液以2％接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)12h；繼續(xù)將1L經(jīng)過(guò)121℃滅菌20min，溫度為10℃的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)入發(fā)酵罐，待溫度升至37℃時(shí)恒溫培養(yǎng)12h；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：麥麩75g，玉米粉55g，米糠25g，豆餅粉20g，β-葡聚糖2g，中草藥粉劑40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑0.5g,純凈水l000mL，pH值5.5，121℃滅菌20min；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調(diào)配方法為：按比例準(zhǔn)確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調(diào)節(jié)PH值5.5，加入3u中溫淀粉酶/g玉米粉與30u高溫淀粉酶/g玉米粉，同時(shí)邊攪拌邊升溫至70℃保溫20min，然后緩慢升溫至90℃保溫20min進(jìn)行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，pH5.5，121℃滅菌35min備用；

所述中草藥粉劑的制備方法如下：

稱取黃芪25份；黨參15份；柴胡12份；麥冬12份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80℃保持3h，然后降溫至50℃，加入混合酶進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為6，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，11W超聲萃取1h，過(guò)濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑；所述混合酶添加量為混合物料總重量的8％；

所述混合酶的重量份數(shù)組成為：β-葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β-淀粉酶18份，果膠酶12份，酸性蛋白酶12份，木瓜蛋白酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份；乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1：1.2；

(3)發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、精濾、干燥得β-葡聚糖酶；

經(jīng)上述制備方法得到的β-葡聚糖酶液體酶活力為10000u/ml。