[發(fā)明專利]里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法及其菌株應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310716987.2
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103740680A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李洪兵;李貴駿;胡永明;易繼云;劉文明
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南鴻鷹生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12R1/885
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法及其菌株應(yīng)用。?

背景技術(shù)：

纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中。細(xì)菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。一般用于生產(chǎn)的纖維素酶來自于真菌，比較典型的有木酶屬(Trichoderma)、曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬(Penicillium）。纖維素酶在食品行業(yè)和環(huán)境行業(yè)均有廣泛應(yīng)用。在進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)，纖維素酶的添加可以增加原料的利用率，并對酒質(zhì)有所提升。?

纖維素酶種類繁多，來源很廣。不同來源的纖維素酶其結(jié)構(gòu)和功能相差很大。由于真菌纖維素酶產(chǎn)量高、活性大，故在畜牧業(yè)和飼料工業(yè)中應(yīng)用的纖維素酶主要是真菌纖維素酶。?

纖維素酶根據(jù)其催化反應(yīng)功能的不同可分為內(nèi)切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan?glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），來自真菌的簡稱EG,來自細(xì)菌的簡稱Cen、外切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan?cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），來自真菌的簡稱CBH,來自細(xì)菌的簡稱Cex)和β-葡聚糖苷酶（β-1,4-glucosidase，EC.3.2.1.21）簡稱BG。內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)切割纖維素多糖鏈內(nèi)部的無定型區(qū),產(chǎn)生不同長度的寡糖和新鏈的末端。外切葡聚糖酶作用于這些還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，釋放葡萄糖或纖維二糖。β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖產(chǎn)生兩分子的葡萄糖。真菌纖維素酶產(chǎn)量高、活性大，在畜牧業(yè)和飼料工作中主要應(yīng)用真菌來源的纖維素酶。?

纖維素酶反應(yīng)和一般酶反應(yīng)不一樣，其最主要的區(qū)別在于纖維素酶是多組分酶系，且底物結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜。由于底物的水不溶性，纖維素酶的吸附作用代替了酶與底物形成的ES復(fù)合物過程。纖維素酶先特異性地吸附在底物纖維素上，然后在幾種組分的協(xié)同作用下將纖維素分解成葡萄糖。?

1950年，Reese等提出了C1-Cx假說，該假說認(rèn)為必須以不同的酶協(xié)同作用，才能將纖維素徹底的水解為葡萄糖。協(xié)同作用一般認(rèn)為是內(nèi)切葡聚糖酶(C1酶)首先進(jìn)攻纖維素的非結(jié)晶區(qū)，形成Cx所需的新的游離末端，然后由CX酶從多糖鏈的還原端或非還原端切下纖維二糖單位，最后由β-葡聚糖苷酶將纖維二糖水解成二個(gè)葡萄糖。不過，纖維素酶的協(xié)同作用順序不是絕對的，隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，C1-Cx和β-葡聚糖苷酶必須同時(shí)存在才能水解天然纖維素。若先用C1酶作用結(jié)晶纖維素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此順序作用卻不能將結(jié)?晶纖維素水解。?

菌種選育是纖維素酶生產(chǎn)的基礎(chǔ)性工作，國內(nèi)外許多專家進(jìn)行了大量研究，為了生產(chǎn)高質(zhì)量的纖維素酶產(chǎn)品，王家林等（1996）在吸收國內(nèi)外經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，先后引進(jìn)了綠色木霉木10、綠色木霉Sn-91014、康氏木霉NT-15、黑曲霉XX-15A，在此基礎(chǔ)上，采用了紫外線、特定電磁波輻射、線性加速器，亞硝基胍等物理、化學(xué)的誘變方法，獲得了高產(chǎn)菌株NT15-H、NT15-H1、XT-15H、XT-15H1。其中木霉NT-15H固體培養(yǎng)活力經(jīng)輕工部食品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心南京站檢測表明，濾紙活力為3670u/g,C1-酶活力24460u/g，Cx-酶活力1800u/g，已達(dá)到國際先進(jìn)水平。此菌種在工廠化生產(chǎn)中性能穩(wěn)定。張苓花等（1998）采用康氏木霉W-925，J-931，經(jīng)過濃度為2%硫酸二乙酯和紫外線（15W、30cm、2min）復(fù)合誘變后，得到了產(chǎn)酶活性高的Wu-932菌種，該菌種CMC糖化力達(dá)到2975，濾紙?zhí)敲富钚詾?31，比出發(fā)菌W-925分別提高了100%和81%?；げ匡暳咸砑觿┘夹g(shù)服務(wù)中心王成書等（1997）采用該中心的里氏木霉A3先進(jìn)行紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變后，將處理過的孢子接種于纖維雙層平板上，30℃培養(yǎng)5-8天，15℃放置7-10天，挑選透明圈直徑和菌落直徑比較大的單菌落進(jìn)行三角瓶固態(tài)發(fā)酵再篩選，得到了產(chǎn)纖維素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。?

纖維素酶的生產(chǎn)工藝主要有兩種，即固體發(fā)酵和液體發(fā)酵，其工藝如下：?