[發明專利]一種高活力飼用復合酶的制備方法

有效

• 申請號: 201310716697.8
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103689241A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 李洪兵;張錦杰;李貴駿;易繼云;劉文明
• 申請（專利權）人: 湖南鴻鷹生物科技有限公司
• 主分類號: A23K1/165
• 分類號: A23K1/165;C12N9/88;C12N9/62;C12N9/42;C12N9/40;C12N9/26;C12N9/18;C12R1/685
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1.一種高活力飼用復合酶的制備方法，其特征在于，以黑曲霉DM-18為原菌株經液體深層發酵制備。

2.如權利要求1所述高活力飼用復合酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：將保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌種經菌種活化和一級、二級、三級液體種子及種子罐擴大培養得到液體種子，以6%接種量接入發酵罐發酵培養基，培養溫度28-30℃，攪拌速度200-700r/m，通風量（V/V）1:1-3,培養時間10-15h；然后以1-2℃/h降溫速率緩慢降溫至10-15℃，恒溫培養15-20h；繼續以1-2℃/h降溫速率緩慢降溫至2-5℃，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養20-30h；最后以1-2℃/h升溫速率緩慢升溫至10-15℃，恒溫培養15-20h；繼續以1-2℃/h升溫速率緩慢升溫至30-33℃，恒溫培養15-20h；發酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得固體飼用復合酶，所述調配過程加入濃縮酶液總重量0.5-5%中草藥粉劑。

3.如權利要求2所述高活力飼用復合酶的制備方法，其特征在于，所述斜面培養基組成為：干酪素4g，磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.8g，硫酸亞鐵0.02g，葡萄糖20g，瓊脂20g，中草藥粉劑5-20g,蒸餾水l000mL，pH值5.8。

4.如權利要求2所述高活力飼用復合酶的制備方法，其特征在于，所述種子培養基組成為：磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.8g，硫酸亞鐵0.02g，葡萄糖20g，中草藥粉劑15-25g,海藻糖10-30g,蒸餾水l000mL，pH值5.5。

5.如權利要求2所述高活力飼用復合酶的制備方法，其特征在于，所述種子罐培養基組成為：玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麩皮10-15g，魚粉10-15g，氯化鈣6-10g，氯化銨1-3g，磷酸氫二鈉1-2g，中草藥粉劑15-20g，海藻糖10-30g，純凈水l000mL，pH值5-7。

6.如權利要求2所述高活力飼用復合酶的制備方法，其特征在于，所述種子罐發酵液菌體濃度為7.0x10⁸-8.0x10⁸個/ml。

7.如權利要求2所述高活力飼用復合酶的制備方法，其特征在于，所述發酵培養基組成為：玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麩皮10-15g，魚粉10-15g，氯化鈣6-10g，氯化銨1-3g，磷酸氫二鈉1-2g，中草藥粉劑30-50g，海藻糖10-30g，純凈水l000mL，pH值5-7。

8.如權利要求2所述高活力飼用復合酶的制備方法，其特征在于，發酵罐發酵過程補料培養基重量百分比組成為：麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25%，魚粉1.0-1.5%，氯化鈣0.6-1.0%，氯化銨0.1-0.3%，磷酸氫二鈉0.1-0.2%，中草藥粉劑5-10%，不足部分純凈水補足，pH值5-7。

9.如權利要求2-8任一所述高活力飼用復合酶的制備方法，其特征在于，所述中草藥粉劑的制備方法如下：稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70℃～90℃保持2～4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質量比例為1：1-1.5，控制溫度至60℃～78℃保持3～4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。

10.如權利要求2所述高活力飼用復合酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）菌種活化

將保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌種接種于斜面培養基，30℃培養42h進行菌種活化，如此活化3次；

所述斜面培養基組成為：干酪素4g，磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.8g，硫酸亞鐵0.02g，葡萄糖20g，瓊脂20g，中草藥粉劑12g,蒸餾水l000mL，pH值5.8，121℃滅菌20min；

所述中草藥粉劑的制備方法如下：

稱取黃芪25份；黨參15份；柴胡12份；黃芩12份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80℃保持3h，添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至70℃保持4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑；

所述乙醇和丙醇的質量比例為1：1.2；

（2）液體種子擴大培養

①一級種子培養：將步驟（1）活化后的斜面菌種以無菌水洗下孢子，接入500毫升搖瓶中，液體種子培養基裝量100毫升，30℃、100rpm搖床培養42h；

②二級種子培養：將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同；

③三級種子培養：將二級種子以8%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，液體培養基裝量1000毫升，30℃、100rpm搖床培養42h；

④種子罐培養：將三級種子以8%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，種子罐培養基裝量100L，控制pH值為6，培養溫度30℃，攪拌速度300rpm，通風量（V/V）1:1,培養時間42h，溶解氧20%；

所述一級、二級、三級種子培養基組成為：磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.8g，硫酸亞鐵0.02g，葡萄糖20g，中草藥粉劑20g,海藻糖20g,蒸餾水l000mL，pH值5.5，121℃滅菌20min；

所述種子罐培養基組成為：玉米粉55g，豆粉20g，麩皮12g，魚粉12g，氯化鈣8g，氯化銨2g，磷酸氫二鈉2g，中草藥粉劑18g，海藻糖20g，純凈水l000mL，pH值6，121℃滅菌20min；

所述種子罐發酵液菌體濃度為7.5x10⁸個/ml；

（3）發酵罐發酵

將步驟（2）中種子罐液體種子以6%接種量接入發酵罐，培養溫度30℃，攪拌速度350r/m，通風量（V/V）1:2,培養時間12h；然后以2℃/h降溫速率緩慢降溫至12℃，恒溫培養18h；繼續以2℃/h降溫速率緩慢降溫至4℃，此時，將步驟（2）中種子罐液體種子以4%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養25h；最后以2℃/h升溫速率緩慢升溫至12℃，恒溫培養18h；繼續以2℃/h升溫速率緩慢升溫至30℃，恒溫培養18h；

溶解氧控制：通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧20%；

PH控制：通過補氨水或稀磷酸，控制發酵過程中pH值保持在5.2；

補料控制：當發酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時，開始添加補料培養基，補料量以維持發酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml；

放罐標準：70%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢；

所述發酵培養基組成為：玉米粉55g，豆粉20g，麩皮12g，魚粉12g，氯化鈣8g，氯化銨2g，磷酸氫二鈉2g，中草藥粉劑40g，海藻糖20g，純凈水l000mL，pH值6，121℃滅菌20min；

所述補料培養基重量百分比組成為：麥芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉18%，魚粉1.2%，氯化鈣0.8%，氯化銨0.2%，磷酸氫二鈉0.2%，中草藥粉劑8%，不足部分純凈水補足，pH值6，123℃滅菌40min；

（4）發酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得固體飼用復合酶；

所述調配過程加入濃縮酶液總重量3%中草藥粉劑。