[發(fā)明專利]一種無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310715572.3
• 申請(qǐng)日: 2013-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN103805620B
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳平華;張卓;陳忠偉;王恒波;施桂姣;項(xiàng)慰;劉迪;邰連賽;高世武;林冰;陳利平;陳容;高三基;許莉萍;陳如凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/62
• 分類號(hào): C12N15/62;C12N15/63;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體及應(yīng)用。

背景技術(shù)

甘蔗黃葉病、花葉病是嚴(yán)重危害甘蔗的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糖業(yè)健康發(fā)展的病毒病，甘蔗黃葉病屬于黃癥病毒科(Luteoviridae)馬鈴薯卷葉病毒(Polerovirus)，其病毒由蛋白質(zhì)外殼及其包裹著的一條單鏈、正義RNA(ssRNA)構(gòu)成，在甘蔗體內(nèi)含量很低，僅分布于其韌皮部篩管伴胞細(xì)胞質(zhì)中。在全球30多個(gè)種植甘蔗的國(guó)家和地區(qū)均有發(fā)生，自2003年王伯輝等報(bào)道廣西發(fā)現(xiàn)甘蔗黃葉病以來(lái)，在我國(guó)桂、粵、滇、瓊、閩等蔗區(qū)也陸續(xù)出現(xiàn)，且有逐年加重的趨勢(shì)。該病的發(fā)生導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量下降,品質(zhì)變劣以及種性退化,嚴(yán)重時(shí)甘蔗產(chǎn)量減產(chǎn)高達(dá)40%~60%。而甘蔗花葉病屬于馬鈴薯Y病毒組，其基因組為正單鏈RNA,約有10000個(gè)核苷酸，主要破壞甘蔗葉片的葉綠體，制約其光合作用，從而使甘蔗糖分減少，產(chǎn)量下降。據(jù)統(tǒng)計(jì)當(dāng)該病病毒侵染率達(dá)到75%時(shí)，產(chǎn)量降低5%~19%，嚴(yán)重影響甘蔗產(chǎn)量。該病在我國(guó)廣東、廣西、浙江、福建、云南、江西、四川、臺(tái)灣均有分布。螟蟲是我國(guó)蔗區(qū)發(fā)生最普遍,危害最嚴(yán)重的甘蔗害蟲,具有全生長(zhǎng)季、鉆蛀性危害的特點(diǎn),苗期枯心率一般達(dá)10%~20%,嚴(yán)重的高達(dá)60%，Bt基因產(chǎn)生的毒蛋白對(duì)螟蟲具有防治作用。甘蔗生長(zhǎng)旺季田間管理難度大，人工成本高，隨著我國(guó)甘蔗機(jī)械化栽培管理的逐步推廣，減少田間管理成本的除草劑甘蔗品種更適宜機(jī)械化栽培管理模式。由于甘蔗是高度雜合的異源多倍體和多倍的非整倍體植物，其遺傳背景非常復(fù)雜，并且抗病蟲、除草劑的甘蔗資源缺乏，因此，很難通過(guò)雜交育種的方式獲得高抗植株。

目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物抗病蟲害方面已廣泛應(yīng)用。2011年張雨良等以甘蔗黃葉病毒CP蛋白基因構(gòu)建RNAi表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)化到煙草中。2012年秦榮等利用RNAi技術(shù)成功構(gòu)建了抗甘蔗花葉病、番茄花葉病的雙價(jià)表達(dá)載體，2004年姚偉等獲得轉(zhuǎn)ScMV-CP基因的轉(zhuǎn)基因甘蔗并進(jìn)行了抗病分析，結(jié)果轉(zhuǎn)基因甘蔗抗性明顯高于非轉(zhuǎn)基因甘蔗。2006年Weng等利用基因槍法將玉米泛素啟動(dòng)子Ubi驅(qū)動(dòng)下的s-Cry1Ac導(dǎo)入甘蔗，用獲得了抗蛀莖蟲的轉(zhuǎn)基因甘蔗，2011年高世武等利用PPT篩選成功獲得抗螟蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗。甘蔗病蟲害往往是多種同時(shí)出現(xiàn)，并趨于多樣性，而現(xiàn)今獲得的轉(zhuǎn)基因甘蔗多屬單一抗性的轉(zhuǎn)基因改良，對(duì)甘蔗病蟲害防治作用有限。對(duì)于感病毒病的作物，RNAi技術(shù)已經(jīng)成為抗病毒轉(zhuǎn)基因作物育種的有效途徑。然而，到目前為止，同時(shí)抗兩種病毒病并具有抗蟲、抗除草劑的轉(zhuǎn)基因甘蔗尚未見報(bào)道。本發(fā)明通過(guò)將甘蔗花葉病毒、黃葉病毒CP基因干擾序列、Cry1AC基因和抗除草劑Bar基因同時(shí)構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，利用基因槍創(chuàng)制了抗病蟲和除草劑的四價(jià)轉(zhuǎn)基因甘蔗，為培育多抗甘蔗新品種提供了新方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體，可用于轉(zhuǎn)化獲得同時(shí)具有4種抗性的轉(zhuǎn)基因作物，并且獲得的轉(zhuǎn)基因作物沒(méi)有抗生素抗性基因，可提高轉(zhuǎn)基因作物的安全性。

本發(fā)明首先提供了一種甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾序列，是由甘蔗花葉病毒外殼蛋白基因和甘蔗黃葉病毒外殼蛋白基因的保守序列融合而成，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。

一種甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾結(jié)構(gòu)，是將所述的甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾序列以反向重復(fù)的方式與丙酮酸磷酸雙激酶PPDK內(nèi)含子相連，以35S為啟動(dòng)子，OCS終止子，如圖2所示。

本發(fā)明還保護(hù)了所述的甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾序列在甘蔗轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體，所述載體的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)（如圖1所示）為：右邊界-35S啟動(dòng)子-正向雙價(jià)抗病序列-內(nèi)含子-反向雙價(jià)抗病序列-OCS終止子-Ubi啟動(dòng)子-抗蟲基因-NOS終止子-NOS啟動(dòng)子-抗除草劑基因-NOS終止子-左邊界，T-DNA區(qū)左右邊界內(nèi)無(wú)抗生素基因，其中正向雙價(jià)抗病序列即甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾序列，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。其中內(nèi)含子為丙酮酸磷酸雙激酶PPDK內(nèi)含子。

所述抗蟲基因?yàn)?i>Cry1AC基因。

所述抗除草劑基因?yàn)?i>Bar基因。

所述載體的構(gòu)建如下：