[發(fā)明專利]一種高活性的甲基對硫磷水解酶突變體及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310714107.8
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN104726426A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭春楊;王磊;鮑蓬;張先恩;張治平;王殿冰;王琳
• 申請（專利權(quán)）人: 北京百川飛虹生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/21;C11D3/386;A23L1/015;B09C1/10
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高活力的甲基對硫磷水解酶及其應(yīng)用。相對于已有的甲基對硫磷水解酶，這種通過定點(diǎn)突變設(shè)計和篩選得到的重組甲基對硫磷水解酶活性顯著提高、具有更強(qiáng)的降解甲基對硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥的能力，以其為基礎(chǔ)開發(fā)的果蔬農(nóng)藥清洗劑效果優(yōu)于市場上同類產(chǎn)品。此外，該酶還可用于果蔬、茶葉、中藥原材料等加工過程的農(nóng)藥去除，以及土壤修復(fù)方面，具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明還公開了上述重組甲基對硫磷水解酶的制備方法。

技術(shù)背景

我國是農(nóng)業(yè)大國，施用農(nóng)藥防治農(nóng)作物的病、蟲、草、鼠害是保障我國農(nóng)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的重要措施之一。其中，有機(jī)磷農(nóng)藥如對硫磷、內(nèi)吸磷、馬拉硫磷、敵敵畏、久效磷、樂果、速滅磷、殺螟松、倍硫磷、甲拌磷、辛硫磷等曾被或正在被廣泛使用。

有機(jī)磷農(nóng)藥是一類相當(dāng)復(fù)雜，組分不均一的化合物，從化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，其基本結(jié)構(gòu)如圖所示。

通常R1、R2是烷基或芳香基，直接或通過氧或硫原子和磷原子連接，有時R1直接與磷原子相連，R2與氧或硫原子相連。有時，二者至少有一個是氨基；氧原子或硫原子通過雙鍵與磷原子相連；X指的是鹵素、脂肪族、芳香族或雜環(huán)基團(tuán)，它通過氧或硫原子與磷原子連接構(gòu)成離去基團(tuán)。由于有多種離去基團(tuán)的結(jié)合，使得化合物有繁多的變化，并且以不同的特性表現(xiàn)出來。

有機(jī)磷殺蟲劑按化學(xué)結(jié)構(gòu)通常可分為5種類型，

1.磷酸酯類：磷酸分子中3個氫原子被有機(jī)基團(tuán)置換了的化合物。如久效磷，敵敵畏；

2.硫代磷酸酯類：磷酸分子中與磷原子相連的氧原子被硫原子置換了的化合物，如對硫磷，甲基對硫磷，馬拉硫磷；

3.磷酰胺類：磷酸分子中羥基被氨基或胺基取代了的化合物，如棉安磷，甲胺磷；

4.焦磷酸酯類：兩個磷酸分子脫去一個水分子形成的化合物稱焦磷酸，焦磷酸被酯化即為焦磷酸酯，如特普，治螟磷；

5.膦酸酯類：磷酸分子中的羥基被有機(jī)基團(tuán)置換形成磷碳鍵的化合物，如敵百蟲，苯硫磷。

隨著有機(jī)磷農(nóng)藥的廣泛使用，中毒事件時有發(fā)生。有機(jī)磷農(nóng)藥的中毒機(jī)理是磷原子與乙酰膽堿酯酶(AChE)共價結(jié)合形成磷酰化酶，從而阻斷了乙酰膽堿的水解，乙酰膽堿在神經(jīng)系統(tǒng)中的積累引起突觸的過度興奮，抑制神經(jīng)沖動傳導(dǎo)，引起一系列神經(jīng)綜合癥，因此對于人畜可造成極大危害。有機(jī)磷農(nóng)藥除了膽堿酯酶毒性效應(yīng)外，許多研究證明其還有非膽堿毒性效應(yīng)，如遺傳毒性，生殖毒性，胚胎毒性或遲發(fā)性神經(jīng)病毒性以及對核酸代謝的影響等。比如，對硫磷(O，O-二乙基-O-對硝基苯基-硫代磷酸酯)和甲基對硫磷(O，O-二甲基-O-對硝基苯基-硫代磷酸酯)是農(nóng)業(yè)保護(hù)中常見的有機(jī)磷農(nóng)藥。對硫磷為廣譜性殺蟲劑、殺螨劑、殺線蟲劑和熏蒸劑，但對人畜有劇毒，對鼠的半致死量為4～13mg/kg體重。甲基對硫磷也是一類高效高毒農(nóng)藥，對鼠的半致死量為14～24mg/kg體重。此類農(nóng)藥雖在許多發(fā)達(dá)國家都已被禁用或限用，且被列入PIC(Prior?Informed?Consent，預(yù)先通知同意)公約，但我國目前仍在大量生產(chǎn)與使用，中毒的事件時有發(fā)生。

甲基對硫磷水解酶MPH(methyl?parathion?hydrolase?E.C.3.1.8.1)對甲基對硫磷、對硫磷、殺螟松和氧樂果等多種有機(jī)磷農(nóng)藥具有降解作用。陳雅麗等分離出一株具有徹底降解甲基對硫磷能力的細(xì)菌，對該菌進(jìn)行生理生化特性及16S?rDNA序列同源性分析，鑒定為假單胞菌，命名為Pseudomonas?sp.WBC-3。該菌能夠以甲基對硫磷為唯一碳源、氮源，將其降解作為生長基質(zhì)。劉虹等將甲基對硫磷水解酶基因mpd位于該菌的大質(zhì)粒pZWL0上。楚曉娜在對Pseudomonas?sp.WBC-3中的甲基對硫磷水解酶(MPH)的研究中實(shí)現(xiàn)了對這個酶的純化，并對MPH的基本性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。劉璐璐等將mph基因在大腸桿菌中進(jìn)行重組研究(參見，陳亞麗等.甲基對硫磷降解假單胞菌WBC-3的篩選及其降解性能的研究.微生物學(xué)報.2002，42(4)：490-7；楚曉娜等.假單胞菌WBC-3甲基對硫磷水解酶性質(zhì)的初步研究.微生物學(xué)報.2003，43(4)：453-9)。

在此基礎(chǔ)上，為開發(fā)高質(zhì)量的農(nóng)藥去除劑，用于家用果蔬農(nóng)藥清洗劑，果蔬、茶葉、中藥原材料等加工過程的農(nóng)藥去除，以及土壤修復(fù)方面，尚需要進(jìn)一步提高甲基對硫磷水解酶降解有機(jī)磷農(nóng)藥的能力，其具體表現(xiàn)為提高對單品種有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率和多品種有機(jī)磷農(nóng)藥的普適性(即所謂的“農(nóng)藥降解廣譜性”)。

發(fā)明內(nèi)容