[發明專利]一種絲狀真菌基因組DNA提取的破壁方法

有效

• 申請號: 201310713074.5
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103695413A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 陳國華;吳廣;陳漢臣;王鳳玲
• 申請（專利權）人: 三峽大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所 42103
• 代理人: 成鋼

1.一種絲狀真菌基因組DNA提取的破壁方法，包括以下步驟，

1）培養：將絲狀真菌接種于液體培養基中，25~30℃環境下，震動培養1~2天，靜止培養2~7天；

2）收集菌體：挑取絲狀真菌菌絲置于離心管中離心，倒掉上清液，收集菌體，再將菌體與滅菌雙蒸水混合菌絲后離心，棄上清，保留真菌菌絲；

3）加提取液：在步驟2）離心后的含菌絲體離心管中加入DNA提取緩沖液，混合菌體和提取緩沖液；

4）凍結：將步驟3）處理得到的菌體放入-28~-18?℃冰箱中，放置1~2?h凍結；

5）破碎絲狀菌體：將步驟4）得到已經凍結的菌體，用滅菌的玻璃棒擠壓破壁；

6）收集基因組DNA溶液：重復步驟4）和步驟5）3~7次后，將破壁后得到的菌體破碎液的一半轉移到另一支離心管中，置于65?℃?恒溫30?min，加入等體積的混合液Ｉ，充分混勻，離心，吸取600~700ｕL上清液移入到同一支的離心管中，同時加入等體積的混合液ＩＩ，充分混勻，離心；

7)?沉淀基因組DNA：將步驟6）得到的上清液移入到新的離心管中，并加入2.5倍體積?-20?℃?預凍的無水乙醇，離心，去上清液，用?75?%的酒精洗滌沉淀2次，揮干后得到絲狀真菌基因組DNA。

2.根據權利要求1所述的絲狀真菌基因組DNA提取的破壁方法，其特征在于：步驟1）中，所述的液體培養基為NBRIP?(National?Botanical?Research?Institute’s?phosphate?medium)或土豆培養基。

3.根據權利要求2所述的絲狀真菌基因組DNA提取的破壁方法，其特征在于：所述的NBRIP培養基每升含有：10?g?C₆H₁₂O₆，5?g?Ca₃(PO₄)₂，5?g?MgCl₂·6H₂O，?0.25?g?MgSO₄·7?H₂O，0.2?g?KCl，0.1?g?(NH₄)₂SO₄，培養基pH為7.0～7.２；所述的土豆培養基含20%?土豆，2%?蔗糖。

4.根據權利要求1所述的一種用于絲狀真菌基因組DNA提取的簡便破壁方法，其特征在于：步驟2）中，將收集的菌絲體用蒸餾水漂洗1~2次，以除去培養基及真菌的代謝產物。

5.根據權利要求1所述的絲狀真菌基因組DNA提取的破壁方法，其特征在于：步驟5）中玻璃棒滅菌，手握端包裹10~15層滅菌脫脂紗布。

6.根據權利要求1所述的絲狀真菌基因組DNA提取的破壁方法，其特征在于：步驟6）中，混合液Ｉ為V_苯酚：V_氯仿：V_異戊醇?=?25：24：1；混合液ＩＩ為V_氯仿：V_異戊醇?=?24：1。

7.根據權利要求1所述的絲狀真菌基因組DNA提取的破壁方法，其特征在于：所述的離心速率為12000?rpm，離心時間為10?min。