[發明專利]一種絲狀真菌基因組DNA提取的破壁方法

有效

• 申請號: 201310713074.5
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103695413A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 陳國華;吳廣;陳漢臣;王鳳玲
• 申請（專利權）人: 三峽大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所 42103
• 代理人: 成鋼

技術領域

本發明涉及一種基因組提取的破壁方法，尤其是絲狀真菌基因組提取過程必要的破壁方法。

背景技術

絲狀真菌廣泛存在于自然界中，并且具有多種多樣的功能，因此絲狀真菌的研究經久未衰，反而越來越引起研究者的關注。微生物研究的第一步就是進行物種鑒定，真菌的傳統分類鑒定依據主要采用培養時的形態特征，而培養特征差異非常顯著，從而影響分類的準確性。真菌的現代分類鑒定則是結合形態學、生理學以及?DNA?分子水平等多方面進行綜合鑒定。DNA?提取是分子水平鑒定的第一步，有關絲狀真菌基因組?DNA?提取的方法有很多。有效地提取絲狀真菌基因組的關鍵在于破壞絲狀真菌細胞壁的程度。絲狀真菌基因組?DNA?提取方法大體相似，差別主要在于采用什么方法破壞絲狀真菌細胞壁。真菌細胞破壁的方法：1）經典的液氮研磨法。需要專用容器裝載購置的液氮，并且在研缽中研磨需要較多的菌絲體，同時由于研缽的敞開面積較大容易引起雜菌污染；液氮容易凍傷皮膚，一些地方液氮不容易獲得而受到限制。2）液氮凍融（和玻璃珠振蕩）法。該方法使用液氮，增加了成本及設備要求。3）酶解法。用于絲狀真菌破壁的酶比較昂貴，在處理大量樣品時很不經濟。4）化學試劑?(氯化芐)?法。化學試劑存在環保上的隱患。

為了得到高質量?DNA?而發展起來的方法一般耗時長，費用高，并需要一些特殊的設備，一般的生物學實驗室很難滿足其要求。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于絲狀真菌基因組DNA提取的簡便破壁方法，能方便、快捷地破碎絲狀真菌的細胞壁，采用常用的離心管和自制普通玻璃棒。采用該方法所獲得的高分子量?DNA?用于PCR等分析，適用于進行分子生物學的研究。

本發明是這樣實現上述目的的：一種絲狀真菌基因組DNA提取的破壁方法，該方法包括以下步驟：

1）將絲狀真菌接種于NBRIP(National?Botanical?Research?Institute’s?phosphate?medium)、土豆培養基液體培養基中進行培養；

2）將步驟1）中培養的絲狀真菌用無菌牙簽挑取置于離心管中離心，倒掉上清液，收集菌體，再將菌體與滅菌雙蒸水混合菌絲后離心（12000?rpm,?10?min），棄上清，保留真菌菌絲；

3）在步驟2）離心后的含菌絲體離心管中加入DNA提取緩沖液，混合菌體和提取緩沖液；

4）將步驟3）處理得到的菌體立即放入-28~-18?℃冰箱中，放置1~2?h凍結；

5）將步驟4）得到已經凍結的菌體，用滅菌的玻璃棒擠壓破壁，重復步驟4）和步驟5）3~7次（凍結-玻璃棒破碎），所述的玻璃棒手握端包裹10-15層滅菌脫脂紗布，方便用力、避免損傷手心；

6）將步驟5）中得到的菌體破碎液的一半轉移到另一支離心管中，然后都置于65?℃?恒溫30?min，加入等體積的混合液?Ｉ(苯酚：氯仿：異戊醇?=?25：24：1)，充分混勻，離心（12000?rpm,?10?min），吸取600~700ｕL上清液移入到另一支離心管中，加入等體積的混合液ＩＩ?(氯仿：異戊醇?=?24：1)，充分混勻，離心（12000?rpm,?10?min）；

7)?將步驟6）得到的上清液移入到新的離心管中，并加入2.5倍體積?-20?℃?預凍的無水乙醇，離心（12000?rpm,?10?min），棄上清，用?75?%的酒精洗滌沉淀2次，揮干后得到基因組DNA可用于PCR擴增等，對于顏色很深難以用混合液去除顏色物質時，將基因組DNA沉淀后再用真菌提取試劑盒分離純化。

本發明提供的一種用于絲狀真菌基因組DNA提取的簡便破壁方法，由于采用-20?℃的普通冰箱和自制的玻璃棒，幾乎所有微生物學實驗室都有配置，避免了特殊設備的需求。不使用液氮可以減少對液氮來源的依賴，并減少了研缽研磨時的雜菌污染。該方法操作方便、經濟實惠，能方便、快捷地獲得絲狀真菌基因組DNA，可以推廣使用。

具體實施方式

實施例1

一種用于絲狀真菌基因組DNA提取的簡便破壁方法，該方法包括以下步驟：