[發(fā)明專(zhuān)利]檢測(cè)MPL基因515位點(diǎn)突變類(lèi)型的方法和引物

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310712442.4
• 申請(qǐng)日: 2013-12-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103757100A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒媛;朱良俊;杜翠;陳紅梅;夏成青
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 鄭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所（普通合伙）
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測(cè)MPL基因515位點(diǎn)突變類(lèi)型的方法和引物。該方法將常規(guī)PCR擴(kuò)增技術(shù)和焦磷酸測(cè)序技術(shù)相結(jié)合起來(lái)，方便快捷，靈敏度高，通量大，適于臨床篩查。

背景技術(shù)

骨髓增殖性腫瘤（MPN）是一種惰性腫瘤，是由造血前體細(xì)胞生長(zhǎng)激活基因改變導(dǎo)致的多細(xì)胞系過(guò)度增殖而引起的。雖然對(duì)造血細(xì)胞的成熟影響較少，但是所有MPN都可通過(guò)不同的頻率轉(zhuǎn)化成急性白血病。由于在MPN中，一系列的染色體重排及突變激活了酪氨酸蛋白激酶(protein?tyrosine?kinases,PTKs)及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使得腫瘤克隆性的增殖大大超越了正常造血細(xì)胞。因此涉及PTKs的分子異常已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于臨床參考、分類(lèi)、微小殘留病灶的監(jiān)測(cè)等，MPL基因即是其中一種。

MPL基因（myeloproliferative?leukemia?gene），編碼血小板生成素受體，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化。該受體參與調(diào)控巨核細(xì)胞的增殖和血小板的生成；此外研究還表明其對(duì)造血干細(xì)胞的維護(hù)、更新和調(diào)節(jié)也起著重要的作用。2006年，Daniela?Pietra等在骨髓纖維化伴骨髓性化生的患者中檢測(cè)到了MPL515位點(diǎn)發(fā)生突變，突變結(jié)果為MPL?W515L。而后的MPL515位點(diǎn)突變篩查中發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性血小板增多癥（ET）及原發(fā)性骨髓纖維化（PMF）患者的MPL515位點(diǎn)突變發(fā)生率分別為1%和5%。

研究發(fā)現(xiàn)伴MPL?W515L/K的ET患者比MPL未突變患者具有年齡高、血小板計(jì)數(shù)高以及隨訪期間動(dòng)脈血栓發(fā)生率顯著增高的特點(diǎn)。而高齡、高白細(xì)胞計(jì)數(shù)、高血紅蛋白水平及過(guò)往的血栓形成史都預(yù)示著ET生存期較差。因此，MPL的突變狀態(tài)不失為引起醫(yī)生了解和關(guān)注患者病情的一個(gè)分子信號(hào)。

目前用于MPL515位點(diǎn)突變檢測(cè)或篩查的方法主要有：Sanger測(cè)序和高靈敏度溶解曲線(xiàn)法（High?Resolution?Melt，HRM）。Sanger測(cè)序法目前是臨床應(yīng)用于檢測(cè)基因突變極其普遍的一種手段，測(cè)序檢測(cè)結(jié)果堪稱(chēng)金標(biāo)準(zhǔn)，但是其靈敏度不高，只能檢出突變比例大于20%的突變樣本。而HRM是廣泛用于篩查基因突變的一種新方法，其靈敏度高，能檢出小于1%甚至0.1%的突變，但是無(wú)法區(qū)分待檢區(qū)段的突變類(lèi)型。只要在引物設(shè)計(jì)區(qū)段內(nèi)，哪怕不是待鑒定位置發(fā)生缺失、插入還是點(diǎn)突變都會(huì)錯(cuò)誤地顯示出突變的結(jié)果。因此，人們需要一種靈敏度和準(zhǔn)確度高，同時(shí)能明確檢測(cè)突變類(lèi)型的篩查方法。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于目前篩查檢測(cè)基因MPL515位點(diǎn)突變方法的不足，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣本中基因MPL515位點(diǎn)突變類(lèi)型的引物，所述引物包括用于擴(kuò)增待檢MPL515位點(diǎn)區(qū)段的一對(duì)擴(kuò)增引物MPL-F和MPL-R，其核苷酸序列為：

MPL-F：5’-CGAAGTCTGACCCTTTTTGTCT-3’

MPL-R：5’-biotin-AGCGAACCAAGAATGCCTGT-3’。

進(jìn)一步地，所述引物還包括一條用于焦磷酸測(cè)序的測(cè)序引物MPL-S，其核苷酸序列為：

MPL-S：5’-GTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGAGG-3’。

進(jìn)一步地，依據(jù)所述測(cè)序引物能獲得MPL515位點(diǎn)野生型和各種突變型的測(cè)序結(jié)果序列：

MPL?W515野生型：TGGCAGTTT

MPL?W515L純合突變型：TTGCAGTTT

MPL?W515K純合突變型：AAGCAGTTT

MPL?W515A純合突變型：GCGCAGTTT

MPL?W515R純合突變型：CGGCAGTTT

MPL?W515S純合突變型：TCGCAGTTT

MPL515W/L雜合突變型：TGCCAAGGTTTTTT

MPL515W/K雜合突變型：TGGACGACGATTTG

MPL515W/R雜合突變型：CTGGGGCCAAGGTTTTTT

MPL515W/S雜合突變型：TGGCGACGATTTG

MPL515W/A雜合突變型：TGCGACGATTTG。

進(jìn)一步地，依據(jù)所述測(cè)序引物在基因MPL515中的結(jié)合位置和所述測(cè)序結(jié)果序列，確定標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)序列，所述標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)序列核苷酸序列如下：

MPL?W515野生型：TG₂CAGT₃

MPL?W515L純合突變型：T₂GCAGT₃