[發明專利]一種檢測液體中內毒素含量的方法

有效

• 申請號: 201310712306.5
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN103675051A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 繆鵬;王弼陡;羅剛銀;錢慶;王鐘周;程文播
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

技術領域

本發明涉及內毒素的檢測技術領域，特別涉及一種檢測液體中內毒素含量的電化學分析方法。

背景技術

內毒素是由多糖、脂質和蛋白質組成的復合體，是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分之一。當細菌破裂后，內毒素會釋放出來，環境中到處存在內毒素。內毒素能引起發熱反應，白細胞反應，內毒素血癥、內毒素休克和彌散性血管內凝血。因此內毒素檢測在環境監測、藥廠質量控制、醫療器械熱原監測等領域具有十分重要的意義。

內毒素具有以下性質：穩定性強，具有耐熱性；抗原性弱，免疫動物后，形成的抗體較少。目前內毒素檢測方法主要有兩種，包括家兔檢測熱源法和鱟試驗法。隨著制藥工業的發展，熱原法已不能適合許多品種的熱原檢查。鱟試驗因其簡單、快速、靈敏、準確的特點，被世界各國廣泛采用，中國藥典和歐美藥典將其定為法定的細菌內毒素檢查法。目前鱟試驗檢測法試劑盒有以下幾種：

(1)凝膠法鱟試劑(定性，半定量)

(2)動態濁度法鱟試劑(定量)

(3)終點濁度法鱟試劑(定量)

(4)動態顯色法鱟試劑(定量)

(5)終點顯色法鱟試劑(定量)

鱟試驗檢測法的檢測容易受到樣品中顯色物質的干擾，而且鱟試劑的凝固過程對光學測量也有一定干擾，此外，鱟試劑反應中G因子旁路也會對檢測的特異性造成影響。利用鱟這種珍稀動物制備鱟試劑成本較高，并且會造成一定程度的生態破壞，基于以上一些因素，鱟試驗的廣泛應用有一定的局限性，對內毒素的檢測需要開發新型的傳感策略。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測液體中內毒素含量的方法，本發明所述方法對內毒素的檢測具有快速、選擇性強、靈敏度高等特點。

本發明提供一種檢測液體中內毒素含量的方法，包括以下步驟：

步驟1)將含飽和鱟C因子的水溶液加入到待測液體中，得到一混合液，待測液體中的內毒素能夠激活所述鱟C因子，產生活性鱟C因子；

步驟2)將經過修飾的電極插入到所述混合液中，電極表面與所述活性鱟C因子發生酶切反應，電極表面的電化學性質被改變；隨后取出電極，插入到另一含電化學活性物質的電解液中，測該電極對所述電解液的電化學響應值；

步驟3)配制至少三個含特定濃度的內毒素標準液，按照步驟1)和2)進行操作后得到相應的至少三組電化學響應值，并將所得電化學響應值繪成標準曲線；將步驟2)中所得電化學響應值與所述標準曲線進行比對，從而得出所述待測液體的內毒素含量；

步驟1)中所用鱟C因子是采用基因重組的方法制得。

優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，步驟1)中所用鱟C因子是采用以下方法制得：從鱟的血液中提取出RNA，逆轉錄出鱟C因子的DNA，在原核表達系統或真核表達系統中重組表達出鱟C因子，并對重組表達出的鱟C因子進行純化。

優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，重組表達出的鱟C因子采用透析法、超濾法、鹽析法、密度梯度離心法、電泳法、離子交換層析法、親和層析法或低溫有機溶劑沉淀法中的任意一種方法進行純化。

優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，步驟2)中所用電極在插入到所述混合液之前，電極表面修飾有包含鱟三肽的多肽序列。

優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，所述多肽序列所含氨基酸數量為5～50個；所述多肽序列配成溶液修飾到電極表面上，所述多肽序列的濃度為0.1μM～100mM；修飾電極的方法采用吸附固定法、共價鍵合法或交聯法中的任意一種。

優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，所述電極為金電極或碳電極。

優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，所述電解液中電化學活性物質選自鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、釕或其配合物、吩惡嗪衍生物或具有電化學性質的納米材料中的任意一種，所述電解液中電化學活性物質的濃度為0.1mM～100mM。

優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，測試電化學響應所用方法選自循環伏安法、計時電量法或示差脈沖伏安法中的任意一種。

優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，所述電極表面的反應溫度為37.0±1℃，所述酶切反應的反應時間為10min～3h。

本發明的有益效果是：通過電化學過程檢測出內毒素的濃度，不受樣品顏色的干擾，不使用鱟試劑，有效地降低了成本，緩解了部分生態壓力，還避免了傳統鱟試劑反應中G因子旁路的干擾。同時，使用基因工程的方法，保證了檢測方法中試劑批次間的均一性，有利于產業化生產，適合于環境監測、藥廠質量控制、醫療器械熱原監測等領域。