[發明專利]一種固定化載體及其制備方法和固定化β-葡萄糖苷酶

在審

• 申請號: 201310712037.2
• 申請日: 2013-12-21
• 公開（公告）號: CN103710333A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 閆云君;陳亭亭;張后今;徐莉;黃霜霜
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/08;C12N11/04;C12N9/42
• 代理公司: 華中科技大學專利中心 42201
• 代理人: 朱仁玲

技術領域

本發明屬于固相化的酶制備領域，更具體地，涉及一種固定化載體及其制備方法和固定化β-葡萄糖苷酶。

背景技術

酶的固定化是指通過物理、化學方法，利用載體將酶限制或束縛在一定的區域內，使酶在此特定區域內進行催化反應的一種酶工程技術。酶的固定化技術因其具有使酶回收及連續化運作，降低生產成本的優勢而成為近年來酶工程領域最為活躍的研究重點之一。

磁性納米顆粒作為固定化載體，由于利于分離和再利用因此應用廣泛。目前磁性納米顆粒載體的制作方法主要用殼聚糖包裹磁性納米核，在殼聚糖表面交聯戊二醛。

然而，這種方法制備的磁性納米顆粒固定化載體，由于采用共價鍵合作用力將酶分子與載體共價交聯在一起，作用力過強，導致酶的三級結構、活性結構域受到不同程度的破壞，對酶活力會造成影響，和游離生物酶相比，活力大幅降低。

β-葡萄糖苷酶，是催化纖維素降解的關鍵酶，固定化的β-葡萄糖苷酶在生物質能源、食品儲存發酵工業、生物醫藥等領域都有重要應用。目前固定化的β-葡萄糖苷酶，主要是采用共價鍵合作用力、物理吸附力或包埋法等方法與功能性磁性納米顆粒結合。其中，共價鍵合作用力過強，造成酶的催化結構域和底物結合結構與都遭到不同程度的破壞，酶活降低；物理吸附力，作用力過若，結合不牢固，導致多次使用后生物酶流失，批次使用效果不穩定；包埋法，β-葡萄糖苷酶的活性位點受到載體的阻礙，影響傳質阻力，導致催化效率降低。

發明內容

針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種固定化載體及其制備方法和固定化β-葡萄糖苷酶，其目的在于采用金屬離子配位鍵將如β-葡萄糖苷酶的生物酶與磁性納米顆粒結合，形成固定化的生物酶，由此解決目前磁性納米顆粒固定化酶的酶活低、生物酶易脫落、操作穩定性低的技術問題。

為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種固定化載體，包括磁性納米顆粒、富羧基復合材料以及過渡金屬離子；其中，磁性納米顆粒平均粒徑在5納米至20納米之間，富羧基復合材料包裹在磁性納米顆粒表面形成富羧基殼，其平均厚度在5納米至30納米之間，其表面羧基與過渡金屬離子絡合，過渡金屬離子用于與待固定化的酶通過金屬離子配位鍵結合。

優選地，所述固定化的載體，其磁性納米顆粒為納米鐵氧化物、納米鈦氧化物或納米硅氧化物。

優選地，所述固定化的載體，其富羧基復合材料包括三層，從里到外依次為多羥基溶膠-凝膠型化合物、環氧氯丙烷和多羧基化合物。

優選地，所述固定化的載體，其過渡金屬離子為Co²⁺、Ni²⁺和/或Mn²⁺，每克載體包含過渡金屬離子20微摩爾至100微摩爾。

按照本發明的另一方面，提供了一種固定化載體制備方法，包括以下步驟：

（1）制備磁性納米顆粒；

（2）對步驟（1）中制備的磁性納米顆粒進行羥基功能化修飾：將步驟（1）中得到的磁性納米顆粒和多羥基溶膠-凝膠型化合物均勻分散于有機溶劑中，強力攪拌同時低溫凝固，去除有機溶劑，獲得包覆有多羥基溶膠-凝膠型化合物的磁性納米顆粒；

（3）對步驟（2）中制備的包覆有多羥基溶膠-凝膠型化合物的磁性納米顆粒進行環氧基功能化修飾：將步驟（2）中獲得包覆有多羥基溶膠-凝膠型化合物的磁性納米顆粒，在堿性條件下均勻分散于環氧氯丙烷的惰性有機溶劑溶液中，去除惰性有機溶劑，獲得環氧基功能化的磁性納米顆粒；

（4）對步驟（3）中制備的環氧基功能化的磁性納米顆粒進行羧基功能化修飾：將步驟（3）中獲得的環氧基功能化的磁性納米顆粒，在堿性還原條件下，與具有氨基殘基或亞氨基殘基的富羧基化合物共價交聯，獲得富羧基復合材料包裹的磁性納米顆粒；

（5）將步驟（4）中獲得的磁性納米顆粒其表面的羧基與過渡金屬離子絡合，即制得固定化載體。

優選地，所述固定化載體制備方法，其步驟（2）所述的多羥基溶膠-凝膠型化合物為瓊脂糖或殼聚糖，所述磁性納米顆粒與多羥基溶膠-凝膠型化合物超聲分散后，采用乳化劑，在65攝氏度下，通過強力攪拌分散于有機溶劑中，所述有機溶劑為甲苯-三氯甲烷溶液，采用磁性分離去除有機溶劑。

優選地，所述固定化載體制備方法，其步驟（3）所述的惰性有機溶劑為二甲基亞砜，采用磁性分離去除有機溶劑。

優選地，所述固定化載體制備方法，其步驟（4）所述的具有氨基殘基或亞氨基殘基的富羧基化合物為亞氨基二乙酸或氨三乙酸，所述富羧基化合物其氨基殘基或亞氨基殘基與環氧基功能化的磁性納米顆粒表面的環氧基發生共價交聯反應。