[發(fā)明專利]一種固定化載體及其制備方法和固定化β-葡萄糖苷酶

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310712037.2
• 申請(qǐng)日: 2013-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103710333A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閆云君;陳亭亭;張后今;徐莉;黃霜霜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N11/14
• 分類號(hào): C12N11/14;C12N11/08;C12N11/04;C12N9/42
• 代理公司: 華中科技大學(xué)專利中心 42201
• 代理人: 朱仁玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于固相化的酶制備領(lǐng)域，更具體地，涉及一種固定化載體及其制備方法和固定化β-葡萄糖苷酶。

背景技術(shù)

酶的固定化是指通過(guò)物理、化學(xué)方法，利用載體將酶限制或束縛在一定的區(qū)域內(nèi)，使酶在此特定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的一種酶工程技術(shù)。酶的固定化技術(shù)因其具有使酶回收及連續(xù)化運(yùn)作，降低生產(chǎn)成本的優(yōu)勢(shì)而成為近年來(lái)酶工程領(lǐng)域最為活躍的研究重點(diǎn)之一。

磁性納米顆粒作為固定化載體，由于利于分離和再利用因此應(yīng)用廣泛。目前磁性納米顆粒載體的制作方法主要用殼聚糖包裹磁性納米核，在殼聚糖表面交聯(lián)戊二醛。

然而，這種方法制備的磁性納米顆粒固定化載體，由于采用共價(jià)鍵合作用力將酶分子與載體共價(jià)交聯(lián)在一起，作用力過(guò)強(qiáng)，導(dǎo)致酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)、活性結(jié)構(gòu)域受到不同程度的破壞，對(duì)酶活力會(huì)造成影響，和游離生物酶相比，活力大幅降低。

β-葡萄糖苷酶，是催化纖維素降解的關(guān)鍵酶，固定化的β-葡萄糖苷酶在生物質(zhì)能源、食品儲(chǔ)存發(fā)酵工業(yè)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域都有重要應(yīng)用。目前固定化的β-葡萄糖苷酶，主要是采用共價(jià)鍵合作用力、物理吸附力或包埋法等方法與功能性磁性納米顆粒結(jié)合。其中，共價(jià)鍵合作用力過(guò)強(qiáng)，造成酶的催化結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)與都遭到不同程度的破壞，酶活降低；物理吸附力，作用力過(guò)若，結(jié)合不牢固，導(dǎo)致多次使用后生物酶流失，批次使用效果不穩(wěn)定；包埋法，β-葡萄糖苷酶的活性位點(diǎn)受到載體的阻礙，影響傳質(zhì)阻力，導(dǎo)致催化效率降低。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種固定化載體及其制備方法和固定化β-葡萄糖苷酶，其目的在于采用金屬離子配位鍵將如β-葡萄糖苷酶的生物酶與磁性納米顆粒結(jié)合，形成固定化的生物酶，由此解決目前磁性納米顆粒固定化酶的酶活低、生物酶易脫落、操作穩(wěn)定性低的技術(shù)問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種固定化載體，包括磁性納米顆粒、富羧基復(fù)合材料以及過(guò)渡金屬離子；其中，磁性納米顆粒平均粒徑在5納米至20納米之間，富羧基復(fù)合材料包裹在磁性納米顆粒表面形成富羧基殼，其平均厚度在5納米至30納米之間，其表面羧基與過(guò)渡金屬離子絡(luò)合，過(guò)渡金屬離子用于與待固定化的酶通過(guò)金屬離子配位鍵結(jié)合。

優(yōu)選地，所述固定化的載體，其磁性納米顆粒為納米鐵氧化物、納米鈦氧化物或納米硅氧化物。

優(yōu)選地，所述固定化的載體，其富羧基復(fù)合材料包括三層，從里到外依次為多羥基溶膠-凝膠型化合物、環(huán)氧氯丙烷和多羧基化合物。

優(yōu)選地，所述固定化的載體，其過(guò)渡金屬離子為Co²⁺、Ni²⁺和/或Mn²⁺，每克載體包含過(guò)渡金屬離子20微摩爾至100微摩爾。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種固定化載體制備方法，包括以下步驟：

（1）制備磁性納米顆粒；

（2）對(duì)步驟（1）中制備的磁性納米顆粒進(jìn)行羥基功能化修飾：將步驟（1）中得到的磁性納米顆粒和多羥基溶膠-凝膠型化合物均勻分散于有機(jī)溶劑中，強(qiáng)力攪拌同時(shí)低溫凝固，去除有機(jī)溶劑，獲得包覆有多羥基溶膠-凝膠型化合物的磁性納米顆粒；

（3）對(duì)步驟（2）中制備的包覆有多羥基溶膠-凝膠型化合物的磁性納米顆粒進(jìn)行環(huán)氧基功能化修飾：將步驟（2）中獲得包覆有多羥基溶膠-凝膠型化合物的磁性納米顆粒，在堿性條件下均勻分散于環(huán)氧氯丙烷的惰性有機(jī)溶劑溶液中，去除惰性有機(jī)溶劑，獲得環(huán)氧基功能化的磁性納米顆粒；

（4）對(duì)步驟（3）中制備的環(huán)氧基功能化的磁性納米顆粒進(jìn)行羧基功能化修飾：將步驟（3）中獲得的環(huán)氧基功能化的磁性納米顆粒，在堿性還原條件下，與具有氨基殘基或亞氨基殘基的富羧基化合物共價(jià)交聯(lián)，獲得富羧基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒；

（5）將步驟（4）中獲得的磁性納米顆粒其表面的羧基與過(guò)渡金屬離子絡(luò)合，即制得固定化載體。

優(yōu)選地，所述固定化載體制備方法，其步驟（2）所述的多羥基溶膠-凝膠型化合物為瓊脂糖或殼聚糖，所述磁性納米顆粒與多羥基溶膠-凝膠型化合物超聲分散后，采用乳化劑，在65攝氏度下，通過(guò)強(qiáng)力攪拌分散于有機(jī)溶劑中，所述有機(jī)溶劑為甲苯-三氯甲烷溶液，采用磁性分離去除有機(jī)溶劑。

優(yōu)選地，所述固定化載體制備方法，其步驟（3）所述的惰性有機(jī)溶劑為二甲基亞砜，采用磁性分離去除有機(jī)溶劑。

優(yōu)選地，所述固定化載體制備方法，其步驟（4）所述的具有氨基殘基或亞氨基殘基的富羧基化合物為亞氨基二乙酸或氨三乙酸，所述富羧基化合物其氨基殘基或亞氨基殘基與環(huán)氧基功能化的磁性納米顆粒表面的環(huán)氧基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)。