[發(fā)明專利]一種固定化載體及其制備方法和固定化β-葡萄糖苷酶

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201310712037.2
• 申請日: 2013-12-21
• 公開（公告）號: CN103710333A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 閆云君;陳亭亭;張后今;徐莉;黃霜霜
• 申請（專利權(quán)）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/08;C12N11/04;C12N9/42
• 代理公司: 華中科技大學專利中心 42201
• 代理人: 朱仁玲

1.一種固定化載體，其特征在于，包括磁性納米顆粒、富羧基復(fù)合材料以及過渡金屬離子；其中，磁性納米顆粒平均粒徑在5納米至20納米之間，富羧基復(fù)合材料包裹在磁性納米顆粒表面形成富羧基殼，其平均厚度在5納米至30納米之間，其表面羧基與過渡金屬離子絡(luò)合，過渡金屬離子用于與待固定化的酶通過金屬離子配位鍵結(jié)合。

2.如權(quán)利要求1所述的固定化的載體，其特征在于，所述磁性納米顆粒為納米鐵氧化物、納米鈦氧化物或納米硅氧化物。

3.如權(quán)利要求1所述的固定化的載體，其特征在于，所述富羧基復(fù)合材料包括三層，從里到外依次為多羥基溶膠-凝膠型化合物、環(huán)氧氯丙烷和多羧基化合物。

4.如權(quán)利要求1所述的固定化載體，其特征在于，所述過渡金屬離子為Co²⁺、Ni²⁺和/或Mn²⁺，每克載體包含過渡金屬離子20微摩爾至100微摩爾。

5.制備如權(quán)利要求1至4任意一項所述固定化載體制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）制備磁性納米顆粒；

（2）對步驟（1）中制備的磁性納米顆粒進行羥基功能化修飾：將步驟（1）中得到的磁性納米顆粒和多羥基溶膠-凝膠型化合物均勻分散于有機溶劑中，強力攪拌同時低溫凝固，去除有機溶劑，獲得包覆有多羥基溶膠-凝膠型化合物的磁性納米顆粒；

（3）對步驟（2）中制備的包覆有多羥基溶膠-凝膠型化合物的磁性納米顆粒進行環(huán)氧基功能化修飾：將步驟（2）中獲得包覆有多羥基溶膠-凝膠型化合物的磁性納米顆粒，在堿性條件下均勻分散于環(huán)氧氯丙烷的惰性有機溶劑溶液中，去除惰性有機溶劑，獲得環(huán)氧基功能化的磁性納米顆粒；

（4）對步驟（3）中制備的環(huán)氧基功能化的磁性納米顆粒進行羧基功能化修飾：將步驟（3）中獲得的環(huán)氧基功能化的磁性納米顆粒，在堿性還原條件下，與具有氨基殘基或亞氨基殘基的富羧基化合物共價交聯(lián)，獲得富羧基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒；

（5）將步驟（4）中獲得的磁性納米顆粒其表面的羧基與過渡金屬離子絡(luò)合，即制得固定化載體。

6.如權(quán)利要求5所述的固定化載體制備方法，其特征在于，步驟（2）所述的多羥基溶膠-凝膠型化合物為瓊脂糖或殼聚糖，所述磁性納米顆粒與多羥基溶膠-凝膠型化合物超聲分散后，采用乳化劑，在65攝氏度下，通過強力攪拌分散于有機溶劑中，所述有機溶劑為甲苯-三氯甲烷溶液，采用磁性分離去除有機溶劑。

7.如權(quán)利要求5所述的固定化載體制備方法，其特征在于，步驟（3）所述的惰性有機溶劑為二甲基亞砜，采用磁性分離去除有機溶劑。

8.如權(quán)利要求5所述的固定化載體制備方法，其特征在于，步驟（4）所述的具有氨基殘基或亞氨基殘基的富羧基化合物為亞氨基二乙酸或氨三乙酸，所述富羧基化合物其氨基殘基或亞氨基殘基與環(huán)氧基功能化的磁性納米顆粒表面的環(huán)氧基發(fā)生共價交聯(lián)反應(yīng)。

9.如權(quán)利要求5所述的固定化載體制備方法，其特征在于，所述步驟（5）絡(luò)合反應(yīng)條件為25攝氏度，搖床混合3小時，搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘。

10.一種固定化的β-葡萄糖苷酶，其特征在于，包括如權(quán)利要求1至4任意一項所述的固定化載體和β-葡萄糖苷酶；所述固定化載體表面的過渡金屬離子和β-葡萄糖苷酶的組氨酸殘基通過金屬離子配位鍵結(jié)合，每克載體表面固定有1毫克到3毫克β-葡萄糖苷酶。