[發(fā)明專利]金魚吻端細(xì)胞系及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310711835.3
• 申請(qǐng)日: 2013-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN103710298A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 景宏麗;高隆英;張旻;張利峰;王娜;林祥梅;吳紹強(qiáng);江育林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N5/10;C12N7/00;C12R1/91
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種金魚吻端細(xì)胞系及其應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

關(guān)于魚類細(xì)胞系的研究，國(guó)內(nèi)外取得了很大的研究進(jìn)展。1962年由Wolf和Quimby建立的虹鱒性腺細(xì)胞系(RGT-2）開始，胖頭魚肌肉細(xì)胞系、劍尾魚胚胎細(xì)胞系SWT、大西洋鱒內(nèi)臟組織細(xì)胞系A(chǔ)S和巴拉圭鲹幼魚細(xì)胞系等多種包括海淡水魚類細(xì)胞系也陸續(xù)建立起來(lái)。魚類原代細(xì)胞系的建立技術(shù)目前是一種較為成熟的技術(shù)，但是要獲得針對(duì)病毒敏感的細(xì)胞系仍存著很大的偶然性和困難性，所以建立一株需要魚類細(xì)胞系有效的途徑是以數(shù)量對(duì)質(zhì)量，即制備大批量的原代細(xì)胞株，從而篩選出敏感的細(xì)胞系。

世界衛(wèi)生組織（OIE）推薦檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物病毒的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”是通過(guò)細(xì)胞來(lái)分離病毒。為了能夠更好有效的分離到水產(chǎn)動(dòng)物的病毒，及早的檢測(cè)出病毒，預(yù)防疾病的爆發(fā)，許多國(guó)內(nèi)外的學(xué)者仍然在進(jìn)行魚類細(xì)胞系的研究。目前尚無(wú)關(guān)于建立金魚吻端細(xì)胞系的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種特性穩(wěn)定、成分均一的金魚吻端細(xì)胞系（GS），是一些水產(chǎn)動(dòng)物病毒的敏感細(xì)胞系，是進(jìn)一步研究未知病毒的良好材料。

本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種金魚吻端細(xì)胞系的制備方法。

本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供所述的金魚吻端細(xì)胞系在對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物病毒分離方面的初步應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

經(jīng)過(guò)篩選，本發(fā)明獲得了特性穩(wěn)定、成分均一的金魚吻端細(xì)胞系，該金魚吻端細(xì)胞系（GS）已于2013年12月4日保存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC），并證明存活，其保藏登記編號(hào)為CGMCC?No.8558，保存地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101，其分類命名為金魚吻端細(xì)胞系。

進(jìn)一步地，所述細(xì)胞系具有以下生物學(xué)特性：

（1）細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，連續(xù)傳代培養(yǎng)50代仍保持該形態(tài)特點(diǎn)；

（2）細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，連續(xù)培養(yǎng)50代仍保持該增殖和生長(zhǎng)特性。

本發(fā)明還提供了一種上述金魚吻端細(xì)胞系的制備方法，該方法包括以下步驟：

（1）取金魚一條，用醫(yī)用酒精浸泡1-5min，于無(wú)菌條件下剪取金魚的吻端，放于濃度為1000u/ml的青霉素-鏈霉素雙抗溶液中，放置10-15min；

（2）胰酶消化液消化10min，然后剪成小塊，用培養(yǎng)基重懸，離心，棄掉上清液，再用培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，離心，棄掉上清，最后加入培養(yǎng)基，重懸混勻；

（3）將步驟（2）制備的重懸混勻液加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

（4）待細(xì)胞鋪板到1/3的時(shí)候，更換新鮮的培養(yǎng)基一次；

（5）待細(xì)胞鋪滿板子，用胰酶消化液進(jìn)行初步消化后，加入新的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

（6）傳代3次后，凍存，復(fù)蘇后能夠繼續(xù)穩(wěn)定增殖生長(zhǎng)，該細(xì)胞系命名為GS。

進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基為含有濃度為100u/ml青霉素-鏈霉素雙抗溶液和20﹪特級(jí)胎牛血清的M199培養(yǎng)基。

進(jìn)一步地，所述胰酶消化液的配制：磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀0.1g，氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，EDTA0.2g，胰酶0.6g，水1000ml。

進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的金魚吻端細(xì)胞系GS可以作為研究水產(chǎn)動(dòng)物病毒宿主細(xì)胞使用，用于水產(chǎn)動(dòng)物病毒的分離。

本發(fā)明的有益效果如下：

實(shí)驗(yàn)中使用的是魚類細(xì)胞培養(yǎng)的最常用的培養(yǎng)基、且在簡(jiǎn)單的條件進(jìn)行原代細(xì)胞篩選培養(yǎng)，保證最終獲得的細(xì)胞無(wú)需特殊試劑和條件就能增殖，為其今后的應(yīng)用提供更好的空間。該金魚吻端細(xì)胞系是首次成功在體外培養(yǎng)。該細(xì)胞在培養(yǎng)7天時(shí)，明顯出現(xiàn)延伸生長(zhǎng)；15天后鋪滿板子，進(jìn)行消化后，具有較強(qiáng)的繁殖能力，呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)16個(gè)月已傳至50代，仍然保持上述形態(tài)特點(diǎn)、生長(zhǎng)和增殖特性。因此，該細(xì)胞是一種特性穩(wěn)定、成分均一的金魚吻端細(xì)胞系，是研究水產(chǎn)動(dòng)物病毒的良好材料。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明；

圖1相差顯微鏡下的金魚吻端細(xì)胞系的形態(tài)；

圖2金魚吻端細(xì)胞系懸浮特性分析

圖3金魚吻端細(xì)胞系的最佳血清濃度的確定；

圖4金魚吻端細(xì)胞系的最佳培養(yǎng)溫度的確定；

圖5金魚吻端細(xì)胞系的倍增曲線分析；

圖6金魚吻端細(xì)胞系的增殖病毒的初步應(yīng)用。

具體實(shí)施方式