[發明專利]雞NK-lysin基因及其克隆方法和表達方法

在審

• 申請號: 201310711614.6
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN103710350A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 徐前明;王貴軍;徐穎;彈啟東;劉思嘉
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C12N15/70
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體說是用分子生物學技術獲得一種雞NK-lysin基因。

背景技術

抗菌肽(antibecterial?peptide，ABP)是一類具有抵抗外來有害微生物侵襲，消除體內自身突變細胞功能的小分子活性肽，也是生物免疫防御系統在收到外界外源病原體侵染時產生的一類生物非特異性免疫應答產物，其廣泛存在于動物的免疫細胞，各種臟器的粘膜，皮膚粘膜及淚腺等。抗菌肽作為生物活性小分子，是一種非專一性的免疫應答產物，具有廣譜抗菌的作用，它不僅對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和一些薄包膜病毒有抵抗作用，對寄生性原蟲，腫瘤細胞也具有廣泛的殺傷作用，卻不破壞動物體內的正常細胞，而且有效作用濃度極低。由于抗菌肽除了具有抑制病原微生物，抗腫瘤的作用，而且活性穩定、不易產生耐藥性、不污染環境，其研究及應用已成為生物制藥領域中的研究熱點，成為克服抗生素濫用導致的耐藥性問題的優異解決方案。

NK-lysin是機體自然殺傷細胞(NK)和毒性T細胞(CTL)中存在的一種被稱之為“顆粒溶素”的抗菌肽，在機體天然免疫和獲得性免疫中發揮了重要作用。研究表明，自然殺傷細胞(NK)和毒性T細胞(CTL)在機體免疫防御系統中與中性粒細胞、巨噬細胞一起發揮著至關重要的作用。在病原物的刺激下，這些細胞會釋放一些溶細胞顆粒作用于靶細胞，而溶細胞顆粒包含了多種蛋白，它們通過干擾靶細胞膜而導致細胞凋亡，以達到抵御病原菌的作用。1987年，Jongstra等從人的T淋巴細胞中分離一種新基因；2000年，Krensky根據該基因位于NK和CTL，將其命名為granulysin(GNLY，顆粒溶素)，該基因編碼的多肽對細菌、真菌、原生動物、寄生蟲等具有廣泛的抗性。隨后，從豬的腸道組織中分離到類似于人的GNLY，且具有抗菌功能，并命名為NK-lysin(NKL)。但是，目前還缺乏關于NK-lysin基因在克隆和表達方面深入的研究。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明公開了一種來源于雞的NK-lysin基因，并采用基因重組技術，對NK-lysin基因進行克隆并構建重組質粒pET-32a-NK-lysin轉化到宿主菌大腸桿菌Rossetta中進行表達。

為實現上述目的，本發明是通過下述技術方案實現的：

首先，本發明公開了雞的NK-lysin基因，該基因具有如序列表中所示的序列1(SEQ?ID?No.1)所示。

具體的，本發明公開了上述基因的克隆方法，所設計的基因PCR擴增引物如下：

上游引物，3’-GTGAAATTCAAGTGCCCCTCA-5’；

下游引物，3’-GCCGGTGCAGTAAATGATGATCTCC-5’。

采用上述引物可以實現NK-lysin基因的克隆，完整的過程如下所示：

首先，從淋巴細胞中提取總RNA，并將上述抽提的淋巴細胞RNA反轉錄為cDNA；

然后，以cDNA為模板，基于上述引物采用PCR方法擴增NK-lysin基因。

在PCR反應完成后，將PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

進一步的，還包括對PCR產物進行純化的步驟，可以采用任意可行的試劑盒對上述PCR產物進行回收，優選的是采用OMEGA膠回收試劑盒進行回收，具體的回收操作可參考試劑盒的操作說明書。

作為上述基因的具體應用，本發明公開了上述基因的表達方法，包括如下兩種：

1.采用PMD-19T作為載體構建重組質粒pMD-19T-NK-lysin，并轉化到宿主菌大腸桿菌DH_5α中進行表達，上述表達的陽性菌經過培養后采用菌落PCR方法，其中的陽性克隆進行序列鑒定。

2.采用pET-32a作為載體在連接酶催化下進行連接反應構建重組表達質粒pET-32a-NK-lysin，并轉化到宿主菌大腸桿菌Rossetta中進行表達，上述表達經IPTG誘導后可成功實現蛋白表達。

附圖說明

圖1為采用RT-PCR方法擴增NK-lysin基因的電泳結果示意圖；

圖2為克隆pMD19T-NK-lysin及pET-32a雙酶切鑒定結果圖；

圖3為pET-32a-NK-lysin融合蛋白SDS-PAGE電泳結果圖；

圖4為NK-lysin基因表達蛋白純化鑒定圖。

具體實施方式

在下述描述中，申請人具體描述了本發明NK-lysin基因的克隆方法、鑒定方法和表達方法，僅用于說明本發明的較佳實現。