[發明專利]用于循環腫瘤細胞快速檢測的適配子型生物傳感器

有效

• 申請號: 201310711267.7
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN103713130A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 唱凱;陳鳴;皮燕;鄧少麗;魯衛平;王豐;賈雙榮;李發科
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N29/00
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 黎昌莉

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種用于循環腫瘤細胞快速檢測的適配子型生物傳感器，還涉及該傳感器的制備方法和應用。

背景技術

腫瘤是直接威脅人類生命健康的重要致死性疾病，近年來其發病率逐漸上升，預計到2030年因腫瘤死亡的人數將達到1500萬。研究證實，惡性腫瘤患者死亡的最主要原因是腫瘤轉移的發生，其占腫瘤相關死亡的90%。腫瘤轉移是一個涉及多步驟多因素的復雜過程，腫瘤細胞在原發灶侵襲、脫落進入循環系統是腫瘤轉移的最初階段，大部分腫瘤細胞由于機體的免疫系統的識別，殺傷及自身凋亡在短期內死亡，只有極少數存活下來轉移到血液、骨髓、淋巴結或遠處器官，發展為轉移灶。腫瘤轉移在疾病的分期、治療及進展中發揮著決定性的作用，因此，腫瘤轉移的早期發現對腫瘤復發和預后的判斷至關重要，并對指導臨床治療有重大意義。

循環腫瘤細胞（circulating?tumor?cells，CTCs）是自發或因診療操作過程中由實體瘤或轉移灶釋放進入外周血循環的腫瘤細胞。研究證實：CTCs存在于乳腺癌、肺癌、膀胱癌、結直腸癌、前列腺癌及卵巢癌中，并且與患者的臨床分期、患者生存期、腫瘤復發、轉移及治療效果密切相關。與傳統的免疫組織化學方法、影像學表現及腫瘤血清學標志物相比，由于外周血液獲取容易且相對無創，CTCs被認為是實時的“液體活檢”，其為腫瘤早期診斷和療效的實時監測提供了新的方向。但是，外周血循環中CTCs數目極少，腫瘤患者血液中每10⁶-10⁷個白細胞中含有1個CTC，并且CTCs釋放入血呈現不連續性和異質性，這使得CTCs快速、靈敏的檢測一直受到挑戰。因此，迫切需要發展一種靈敏度高、特異性好、無需標記、實時監測、操作簡單的CTCs檢測方法。

目前，CTCs的檢測包括富集和檢測兩個步驟，其中為了實現CTCs的檢測主要包括以下兩種策略：①免疫表型的分析方法（CellSearch，EPISPOT，CTC-chip等），②通過PCR擴增惡性細胞突變的方法。但是這些方法由于需特殊檢測儀器和操作復雜而受限，同時技術上需要熒光或生物學標記，且結果存在重復性差，假陽性，難以標準化判定等問題。

生物傳感器(biosensor)是對生物物質敏感并將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器，由固定化的生物敏感材料作識別元件（包括酶、抗體、抗原、微生物、細胞、組織、核酸等生物活性物質）與適當的理化換能器（如氧電極、光敏管、場效應管、壓電晶體等等）及信號放大裝置構成的分析工具或系統。生物傳感器由于集高效、靈敏、特異、結構小巧、經濟實用等優點于一身，目前已成為生命科學領域的研究熱點。近年來，隨著聲光、微電子技術的發展，一種新型傳感器——漏聲表面波(Leaky?Surface?Acoustic?Wave,LSAW)傳感器逐漸發展起來。它利用了壓電晶體的特殊切向（如：Y方向切割36°旋轉、X方向傳播的LiTaO₃晶體）激勵出LSAW，當LSAW傳播路徑表面的質量負載發生微小改變時（靶序列與固定的探針發生反應），傳感器表面的邊界條件將發生改變，導致LSAW傳播的頻率和相位發生相應的改變，此時從傳感器輸出換能器提取的電信號的頻率和相位即可隨之發生變化，從而可極為敏感地探測出與傳感器晶體表面固定的探針發生特異性反應的待測靶物質。總體上講，LSAW傳感器具有如下幾個優點：1）高靈敏度，高精度；2）重復性及可靠性更好；3）功耗低；4）結構工藝性好。這使LSAW傳感器具有了非常廣泛的應用前景。

適配子（aptamer）是通過指數富集配基系統進化技術（SELEX）篩選得到的DNA或RNA核酸序列。SELEX是一種從大容量寡核苷酸文庫中經反復分離擴增步驟得到針對靶分子的高親和力高特異性核酸配基—適配子的體外篩選技術，主要包括結合、分離、洗脫、擴增和調節五個步驟。首先將包含有10¹³-10¹⁵個隨機序列的核苷酸序列庫（ssDNA文庫、RNA文庫）與靶分子混合溫育，隨后通過物理方法分離出結合了靶分子的核苷酸序列。洗脫收集獲得結合序列，并將結合序列進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增生成次級文庫，用于下輪篩選。一幫通過6-20輪SELEX循環，對已達到高親和力的擴增產物進行克隆測序，從而獲得特異性識別靶分子的適配子。