[發(fā)明專(zhuān)利]一種紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的分子鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310710653.4
• 申請(qǐng)日: 2013-12-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103667495A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙艷紅;廖小芳;陳鵬;周瑞陽(yáng);周瓊;周步進(jìn)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的分子鑒定方法。

背景技術(shù)

紅麻又稱(chēng)“洋麻”，是錦葵科木槿屬一年生韌皮纖維作物。因其在長(zhǎng)江流域及其以北地區(qū)不能自然留種，北方麻區(qū)每年要從華南地區(qū)調(diào)入大量種子。紅麻表現(xiàn)出強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢(shì)，其優(yōu)勢(shì)率高達(dá)35%～40%。長(zhǎng)期以來(lái)，紅麻雜種優(yōu)勢(shì)利用是國(guó)內(nèi)外紅麻育種的主攻目標(biāo)。不育系的培育是利用雜種優(yōu)勢(shì)的重要基礎(chǔ)，其中細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic?male?sterility，簡(jiǎn)稱(chēng)CMS）是常見(jiàn)的不育系類(lèi)型。

2008年9月，廣西大學(xué)周瑞陽(yáng)發(fā)明的“紅麻野敗型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育方法”獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利（ZL200510019454.4）。按此方法已選育出了K03A（見(jiàn)：桂科鑒字第[2004]152號(hào)）、福3A、P3A、917A、722A、763A和L23A（見(jiàn)：桂科鑒字第[2007]177號(hào)）等7個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，紅麻雜種優(yōu)勢(shì)利用取得突破性進(jìn)展。

但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由單一細(xì)胞質(zhì)雄性不育系組配的雜交種的大面積推廣和長(zhǎng)期利用存在某一病害大流行的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)樵摷?xì)胞質(zhì)雄性不育系組配的雜交種可能成為某一病原微生物生理小種的哺育品種。解決這一問(wèn)題的基本途徑是選育出多種細(xì)胞質(zhì)來(lái)源的雄性不育系，并在生產(chǎn)中推廣不同細(xì)胞質(zhì)來(lái)源的三系雜交種。

為了選育新的雄性不育細(xì)胞質(zhì)，一般利用現(xiàn)有雄性不育保持系與現(xiàn)有種質(zhì)資源測(cè)交的方法篩選，不但工作量很大，而且?guī)в泻艽蟮拿つ啃浴?/p>

若能找到一種雄性不育細(xì)胞質(zhì)的分子標(biāo)記，則可利用這種標(biāo)記對(duì)現(xiàn)有種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定，以發(fā)掘出新的雄性不育細(xì)胞質(zhì)資源，繼而選育出新的雄性不育系。由此將極大地提高工作效率，并有利于現(xiàn)有雄性不育系及其雜交種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)。

關(guān)于紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)分子鑒定方法，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是解決目前缺乏紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)分子鑒定方法的問(wèn)題，提供一種紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的分子鑒定方法。

本發(fā)明采用的是ALP（Amplified?Length?Polymorphism，擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性）技術(shù)，是針對(duì)特定的位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)得到的DNA多態(tài)性，以此做為分子標(biāo)記的技術(shù)。

本發(fā)明提供的一種紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的分子鑒定方法，具體步驟如下：

用ALP分子標(biāo)記技術(shù)的特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增待測(cè)紅麻樣本的線粒體DNA，能擴(kuò)增出與細(xì)胞質(zhì)雄性不育系具有相同特異性條帶的即為含紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的材料；

所述特異性引物為atp6BQ引物對(duì)：

正向引物5’-TATGTTTGTAAATATCACGTCTGCG-3’（如SEQID?No.3所示）

反向引物5’-TTAGCAGCATAAACAAAGATGGATT-3’（如SEQID?No.4所示）。

其中，所述PCR的反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)體系用雙蒸水補(bǔ)足到總體積20μl。

其中，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃40s，58℃40s，72℃40s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

本發(fā)明還提供用于鑒定紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的atp6BQ引物對(duì)：

正向引物5’-TATGTTTGTAAATATCACGTCTGCG-3’（如SEQID?No.3所示）

反向引物5’-TTAGCAGCATAAACAAAGATGGATT-3’（如SEQID?No.4所示）

本發(fā)明還提供用于鑒定紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的分子標(biāo)記MM509，其為用如SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示的引物擴(kuò)增出長(zhǎng)度為509bp的特異性條帶。

本發(fā)明的還一個(gè)目的在于提供所述紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的分子鑒定方法在紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供用所述的標(biāo)記或引物在鑒定紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用ALP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)含紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系材料進(jìn)行了分子水平的多態(tài)性檢測(cè)，從本研究的結(jié)果中可以看出，兩種標(biāo)記鑒定的結(jié)果條帶清晰、穩(wěn)定、可靠，因此本發(fā)明的方法非常適用于對(duì)含紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系材料進(jìn)行鑒定和進(jìn)行新紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系材料的分子標(biāo)記輔助選育。

附圖說(shuō)明