[發明專利]一種構建DNA高通量測序文庫的方法及其配套試劑盒

有效

• 申請號: 201310706375.5
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN103668471A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 李鑫輝;楊文超;邵志峰
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 祝蓮君;劉真真

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種構建DNA高通量測序文庫的方法及其配套試劑盒。

背景技術

隨著高通量測序技術的不斷普及，已經出現了針對不同形式核酸樣品的各種高通量測序文庫構建方法，其中包括雙鏈DNA(Bentley,D.R.,et?al.,Accurate?whole?human?genome?sequencing?using?reversible?terminator?chemistry.Nature,2008.456(7218):p.53-9)、單鏈DNA(Smith,D.J.and?I.Whitehouse,Intrinsic?coupling?of?lagging-strand?synthesis?to?chromatin?assembly.Nature,2012.483(7390):p.434-8.)、RNA(Mortazavi,A.,et?al.,Mapping?and?quantifying?mammalian?transcriptomes?by?RNA-Seq.Nat?Methods,2008.5(7):p.621-8)以及小RNA(Zhang,H.,et?al.,Genome-wide?analysis?of?small?RNA?and?novel?MicroRNA?discovery?in?human?acute?lymphoblastic?leukemia?based?on?extensive?sequencing?approach.PLoS?One,2009.4(9):p.e6849)等。這些方法通常都要求較大的樣品起始量，一般是200ng以上。然而，當起始樣品量較少時(少至50pg)，由于分子碰撞幾率降低以及雜質干擾，連接和擴增反應的難度都會大大增加。

因此，本領域尚缺乏一種專門針對少量DNA樣品的高通量測序文庫構建方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種專門針對少量DNA樣品的高通量測序文庫構建方法。

本發明的第一方面，提供了一種基于核酸樣品構建測序文庫的方法，所述方法包括步驟：

(a)提供一用于構建測序文庫的核酸樣品；

(b)對所述核酸樣品進行變性處理，使所述核酸解鏈為單鏈核酸；

(c)將所述單鏈核酸與第一銜接子(adaptor)進行退火反應，從而使得第一銜接子捕獲所述單鏈，并進行連接反應，從而形成“第一銜接子-單鏈核酸”復合物，其中所述第一銜接子為雙鏈，正鏈的5’端連接有生物素并且3’端具有呈單鏈形式的、用于捕獲單鏈核酸的第一捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列；

(d)將“第一銜接子-單鏈核酸”復合物與表面包被有親和素的磁珠進行混合，從而將所述的“第一銜接子-單鏈核酸”復合物吸附于所述磁珠；

(e)對上一步驟獲得的磁珠進行清洗，獲得經清洗的、吸附有“第一銜接子-單鏈核酸”復合物的磁珠；

(f)將上一步驟獲得的、經清洗的且吸附有“第一銜接子-單鏈核酸”復合物的磁珠與第二銜接子進行退火反應，從而使得第二銜接子結合于所述單鏈的游離端，并進行連接反應，從而形成吸附有“第一銜接子-單鏈核酸-第二銜接子”復合物的磁珠，

其中所述第二銜接子為雙鏈，正鏈的5’端具有呈單鏈形式的、用于結合于單鏈核酸的第二捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列；

(g)對上一步驟獲得的磁珠進行清洗，獲得經清洗的、吸附有“第一銜接子-單鏈核酸-第二銜接子”復合物的磁珠；

(h)將上一步驟獲得的經清洗的磁珠，用特異性結合于第一銜接子的第一引物和特異性結合于第二銜接子的第二引物，進行PCR反應，獲得第一擴增產物，用于構建測序文庫。

在另一優選例中，所述核酸樣品的總量為10-200pg。

在另一優選例中，所述方法還包括：

(i)以第一擴增產物為模板，用第三引物和第四引物進行PCR擴增，從而獲得第二擴增產物，其中所述的第二擴增產物的兩端引入了測序接頭序列。

在另一優選例中，所述的第三引物的5’端含有測序接頭序列且3’端含有部分或全部第一引物序列；而所述的第四引物與第二引物相同。

在另一優選例中，所述的第一銜接頭的結構如下，從5’至3’端：

生物素標記物-雙鏈互補區-單鏈捕獲區

其中，雙鏈互補區的長度為15-100bp；而單鏈捕獲區的長度為5-10bp。

在另一優選例中，所述的核酸樣品的總量為20-100pg。

在另一優選例中，所述的核酸樣品包括DNA樣品、RNA樣品。