[發(fā)明專利]一種構(gòu)建DNA高通量測序文庫的方法及其配套試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310706375.5
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN103668471A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李鑫輝;楊文超;邵志峰
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 上海一平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 祝蓮君;劉真真

1.一種基于核酸樣品構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，包括步驟：

(a)提供一用于構(gòu)建測序文庫的核酸樣品；

(b)對所述核酸樣品進(jìn)行變性處理，使所述核酸解鏈為單鏈核酸；

(c)將所述單鏈核酸與第一銜接子(adaptor)進(jìn)行退火反應(yīng)，從而使得第一銜接子捕獲所述單鏈，并進(jìn)行連接反應(yīng)，從而形成“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物，其中所述第一銜接子為雙鏈，正鏈的5’端連接有生物素并且3’端具有呈單鏈形式的、用于捕獲單鏈核酸的第一捕獲序列，而負(fù)鏈為與正鏈互補(bǔ)的序列；

(d)將“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物與表面包被有親和素的磁珠進(jìn)行混合，從而將所述的“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物吸附于所述磁珠；

(e)對上一步驟獲得的磁珠進(jìn)行清洗，獲得經(jīng)清洗的、吸附有“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物的磁珠；

(f)將上一步驟獲得的、經(jīng)清洗的且吸附有“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物的磁珠與第二銜接子進(jìn)行退火反應(yīng)，從而使得第二銜接子結(jié)合于所述單鏈的游離端，并進(jìn)行連接反應(yīng)，從而形成吸附有“第一銜接子-單鏈核酸-第二銜接子”復(fù)合物的磁珠，

其中所述第二銜接子為雙鏈，正鏈的5’端具有呈單鏈形式的、用于結(jié)合于單鏈核酸的第二捕獲序列，而負(fù)鏈為與正鏈互補(bǔ)的序列；

(g)對上一步驟獲得的磁珠進(jìn)行清洗，獲得經(jīng)清洗的、吸附有“第一銜接子-單鏈核酸-第二銜接子”復(fù)合物的磁珠；

(h)將上一步驟獲得的經(jīng)清洗的磁珠，用特異性結(jié)合于第一銜接子的第一引物和特異性結(jié)合于第二銜接子的第二引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物，用于構(gòu)建測序文庫。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：

(i)以第一擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用第三引物和第四引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得第二擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述的第二擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端引入了測序接頭序列。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的第三引物的5’端含有測序接頭序列且3’端含有部分或全部第一引物序列；而所述的第四引物與第二引物相同。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一銜接頭的結(jié)構(gòu)如下，從5’至3’端：

生物素標(biāo)記物-雙鏈互補(bǔ)區(qū)-單鏈捕獲區(qū)

其中，雙鏈互補(bǔ)區(qū)的長度為15-100bp；而單鏈捕獲區(qū)的長度為5-10bp。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸樣品的總量為20-100pg。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸樣品包括DNA樣品、RNA樣品。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的捕獲序列為5-8個(gè)堿基的隨機(jī)序列。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，

所述的第一銜接子的正鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ?ID?NO:1所示；

所述的第一銜接子的反鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ?ID?NO:2所示；

所述的第二銜接子的正鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ?ID?NO:3所示；

所述的第二銜接子的反鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ?ID?NO:4所示。

9.一種基于核酸樣品構(gòu)建測序文庫的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

一第一銜接子，所述第一銜接子為雙鏈，正鏈的5’端連接有生物素標(biāo)記物并且3’端具有呈單鏈形式的、用于捕獲單鏈核酸的第一捕獲序列，而負(fù)鏈為與正鏈互補(bǔ)的序列；

一第二銜接子，所述的第二銜接子為雙鏈，正鏈的5’端具有呈單鏈形式的、用于結(jié)合于單鏈核酸的第二捕獲序列，而負(fù)鏈為與正鏈互補(bǔ)的序列；

一磁珠，所述磁珠表面包被有親和素；

和說明書，所述的說明書記載了使用方法。

10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：特異性結(jié)合于第一銜接子的第一引物；和特異性結(jié)合于第二銜接子的第二引物。