[發(fā)明專利]一種表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的家蠶重組桿狀病毒的純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310705625.3
• 申請日: 2013-12-16
• 公開（公告）號: CN104711232B
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張耀洲
• 申請（專利權(quán)）人: 特菲（天津）生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12R1/93
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33228
• 代理人: 沈亞芳

本發(fā)明提供一種表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的家蠶重組桿狀病毒的純化方法，它以感染了重組桿狀病毒NPV?gp64?HA的蠶蛹為原料，與無菌水進行混合后進行勻漿，取勻漿液低速離心，取低速離心的稠狀溶液高速離心，取高速離心的上清用0.1μm膜包超濾，取截留液超速離心，得到黑團用超濾液重懸過夜，蔗糖密度梯度離心，然后取區(qū)帶后活性高的樣品，300KD膜包超濾，0.22μm濾膜過濾，收集截留液，獲得表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的病毒粒子。該方法可以獲得具有較純的在家蠶桿狀病毒表面展示有禽流感H5N1HA蛋白的病毒粒子。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白（75KD）的家蠶重組桿狀病毒的純化方法。

背景技術(shù)

桿狀病毒基因組為130kb左右，因此可以容納較大的外源DNA片段。病毒基因組中多角體蛋白基因是病毒感染晚期高效表達的基因，卻是病毒復制增殖的非必需區(qū)，因此適于插入外源基因的多拷貝。該基因受強啟動子調(diào)控，可較高水平表達外源蛋白。外源DNA插入多角體蛋白基因內(nèi)，使此基因功能喪失，不能再合成多角體蛋白。而野生型病毒多角體蛋白基因表達出大量產(chǎn)物形成包涵體，篩選時極易將之與重組病毒區(qū)別開來。另外，桿狀病毒表面展示系統(tǒng)能夠完成翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾，使外源產(chǎn)物具有較高生物學活性。

本申請人構(gòu)建了重組家蠶桿狀病毒，將H5N1型流感病毒表面HA蛋白與桿狀病毒囊膜表面gp64蛋白在家蠶細胞中融合表達，其定位于受重組桿狀病毒感染的家蠶細胞膜表面。當桿狀病毒通過出芽方式從細胞釋放出來時，大部分病毒會形成帶有融合蛋白的病毒包膜。這樣，通過篩選就可以鑒定出表面展示有目的蛋白（HA蛋白）的重組桿狀病毒。

純化病毒的方法主要有沉淀法、離心法和透析法等。目前病毒粒子的純化大多用離心法，較常使用的梯度材料有蔗糖、甘油、氯化銫和重水等?，F(xiàn)有的表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的家蠶重組桿狀病毒粒子的純化方法，存在步驟復雜繁瑣，成本較高，純化效率低等問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的家蠶重組桿狀病毒的純化方法，該方法主要依據(jù)HA蛋白和病毒粒子分子量大小，通過簡單的勻漿，低速離心，高速離心，超速離心超濾和過濾方法，獲得具有較純的在家蠶桿狀病毒表面展示有禽流感H5N1HA蛋白的病毒粒子。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的家蠶重組桿狀病毒的純化方法，它以感染了重組桿狀病毒NPV-gp64-HA的蠶蛹為原料，與無菌水進行混合后進行勻漿，取勻漿液低速離心，取低速離心的稠狀溶液高速離心，取高速離心的上清用0.1μm膜包超濾，取截留液超速離心，得到黑團用超濾液重懸過夜，蔗糖密度梯度離心，然后取區(qū)帶后活性高的樣品，300KD膜包超濾，0.22μm濾膜過濾，收集截留液，獲得表面展示有H5N1流感病毒HA蛋白的病毒粒子。

作為優(yōu)選，所述蠶蛹與無菌水混合的質(zhì)量比為1：3。

作為優(yōu)選，所述低速離心在20℃的溫度條件下進行；所述高速離心在4℃的溫度條件下進行；所述超速離心在10℃的溫度條件下進行。

作為優(yōu)選，所述低速離心速率為8000rpm；所述高速離心的速率為15000rpm；所述超速離心的速率為50000rpm；所述蔗糖密度梯度離心的速率為35000rpm。

作為優(yōu)選，所述蔗糖密度梯度離心所用蔗糖密度為30%蔗糖、55%蔗糖。所用試劑PB：NaCl85.0g、Na₂HPO₄70.0g、NaH₂PO₄3.4g、EDTA4.0g倒入裝有純化水的5L燒杯中，溶解后用1L量筒定容至1L。

作為優(yōu)選，所述區(qū)帶后活性高的樣品在超濾之前，用1：4000的β-丙內(nèi)酯，4℃滅活24小時，37℃水解4小時。