[發明專利]重組質粒、利用該重組質粒制備的重組桿狀病毒以及該病毒在疫苗制備中的應用

在審

• 申請號: 201310705623.4
• 申請日: 2013-12-16
• 公開（公告）號: CN104711290A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發明（設計）人: 張耀洲;盛穩穩;崔立旺;郭慶拓;舒特俊;陳劍清;蓋其靜
• 申請（專利權）人: 特菲（天津）生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N7/01;C12N15/30;C07K19/00;A61K39/015;A61P33/06
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務所(普通合伙) 33228
• 代理人: 沈亞芳

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種經改造的桿狀病毒質粒即重組質粒，利用該重組質粒制備的含目的基因（間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25基因）的重組桿狀病毒，該重組桿狀病毒的制備方法，該重組桿狀病毒表達的融合蛋白，以及該重組桿狀病毒和該融合蛋白在間日瘧傳播阻斷疫苗制備中的應用。?

背景技術

間日瘧是由間日瘧原蟲引起的周期性發作的急性傳染病，特點是間隔48小時反復發作。如今面世的集中抗瘧疾藥物也由于抗藥性瘧原蟲以及耐殺蟲劑傳播蚊的出現而面臨挑戰。制備瘧疾疫苗也就成為了能有效控制瘧疾傳播的主要手段。其中傳播阻斷疫苗是以蚊階段瘧原蟲特異表達的蟲體表面蛋白作為抗原免疫人體，使之產生抗蚊階段瘧原蟲表面蛋白的特異性抗體。間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25是瘧疾研究的主要靶點，其在不同地區的瘧疾病毒株間具有很高的保守性。?

現在的生物技術常用的生物體是各種種類的酵母菌核大腸桿菌，但是通過大腸桿菌表達出來的Pvs25蛋白在傳播阻斷實驗中并沒有檢測到有明顯的免疫原性和免疫保護性，而用酵母其中的畢赤酵母表達的Pvs25蛋白可以有很好的表達，得到的抗體也可以檢測到免疫原性和保護性，而且已經進入了臨床I期，但是在進入下一期臨床的時候，人體產生了排斥反應。現如今表達的哺乳動物表達系統可以看到效果，但是表達量很低，成本相對較高，不滿足大量生產需要。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對以上現有技術的不足，提供一種重組桿狀病毒質粒，利用該重組質粒構建表面展示間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25的重組桿狀病毒，通過簡單地分離純化病毒粒子，制備抗體具有良好的抗體效價，能夠為間日瘧傳播阻斷疫苗的研究提供參考。在家蠶BmN細胞中傳代培養細胞獲得F3代病毒，以此F3代病毒接種家蠶BmN，從細胞中分離純化獲得病毒粒子，其可以直接作為疫苗，免疫Balb/c小鼠，間接ELISA檢測抗體效價能達到1:25600。此種方法相比較原核的和其他的真核表達系統生產疫苗的方法具有安全性好、生產成本低、易于大規模生產操作的特點。?

本發明所采用的技術方案為：?

一種重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM，該重組質粒由一段重組序列插入到pFastBacDual質粒中構建而成，所述重組序列為根據CMV、Pph、SP、TM已知序列，在SP和TM核苷酸序列間加入Xba?I酶切位點和Xho?I酶切位點，CMV-F前加入KpnI酶切位點，TM-R后加入HindIII酶切位點形成，所述重組序列全長為923bp，如SEQ?ID?NO：1所示。?

具體地，所述重組序列插入到pFastBacDual質粒的KpnI酶切位點和HindIII酶切位點之間。?

本發明進一步提供利用上述重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM構建的重組桿狀病毒BmPvs25，該重組桿狀病毒由間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25基因插入到重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM并通過轉座與穿梭載體Bacmid的基因組進行同源重組，獲得重組桿狀病毒基因組DNA，然后將重組桿狀病毒基因組DNA轉染家蠶細胞，在家蠶細胞內包裝得到表面展示有間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25的重組桿狀病毒。?

具體地，所述Pvs25基因插入到重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM的Xba?I酶切位點和Xho?I酶切位點之間。?

具體地，所述家蠶細胞為家蠶BmN細胞。?

穿梭載體Bacmid（即Baculovirusplasmid）為帶有桿狀病毒基因組的質粒，可在細菌和昆蟲細胞之間穿梭，是Bac-to-bac桿狀病毒表達系統的成員之一，該系統還包括供體質粒和輔助質粒及大腸桿菌，為現有技術。?

載體pFastBacDual是Bac-to-bac表達系統的供體質粒，可以插入外源基因并在輔助質粒編碼的轉座酶作用下，將外源基因插入到Bacmid中。載體pFastBacDual已經商品化；CMV啟動子為哺乳動物啟動子，將其插入桿狀病毒后，桿狀病毒可以在哺乳動物里表達外源基因。?

上述重組桿狀病毒BmPvs25的制備方法，包括以下步驟：?

（1）通過PCR擴增的方法得到間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25基因，然后將Pvs25基因連接到重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM的Xba?I酶切位點和Xho?I酶切位點之間，得到重組轉座質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-Pvs25-TM；?