[發明專利]重組質粒、利用該重組質粒制備的重組桿狀病毒以及該病毒在疫苗制備中的應用

在審

• 申請號: 201310705623.4
• 申請日: 2013-12-16
• 公開（公告）號: CN104711290A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發明（設計）人: 張耀洲;盛穩穩;崔立旺;郭慶拓;舒特俊;陳劍清;蓋其靜
• 申請（專利權）人: 特菲（天津）生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N7/01;C12N15/30;C07K19/00;A61K39/015;A61P33/06
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務所(普通合伙) 33228
• 代理人: 沈亞芳

1.一種重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM，其特征在于：由一段重組序列插入到pFastBacDual質粒中構建而成，所述重組序列為根據CMV、Pph、SP、TM已知序列，在SP和TM核苷酸序列間加入Xba?I酶切位點和Xho?I酶切位點，CMV-F前加入KpnI酶切位點，TM-R后加入HindIII酶切位點形成，所述重組序列全長為923bp，如SEQ?ID?NO：1所示。

2.根據權利要求1所述的重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM，其特征在于：所述重組序列具體插入到pFastBacDual質粒的KpnI酶切位點和HindIII酶切位點之間。

3.利用權利要求1所述的重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM構建的重組桿狀病毒BmPvs25，其特征在于：由間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25基因插入到重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM并通過轉座與穿梭載體Bacmid的基因組進行同源重組，獲得重組桿狀病毒基因組DNA，然后將重組桿狀病毒基因組DNA轉染家蠶細胞，在家蠶細胞內包裝得到表面展示有間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25的重組桿狀病毒。

4.根據權利要求3所述的重組桿狀病毒BmPvs25，其特征在于：所述Pvs25基因具體插入到重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM的Xba?I酶切位點和Xho?I酶切位點之間。

5.根據權利要求3所述的重組桿狀病毒BmPvs25，其特征在于：所述家蠶細胞為家蠶BmN細胞。

6.權利要求3-5任一權利要求所述的重組桿狀病毒BmPvs25的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）通過PCR擴增的方法得到間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25基因，然后將Pvs25基因連接到重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM的Xba?I酶切位點和Xho?I酶切位點之間，得到重組轉座質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-Pvs25-TM；

（2）將重組轉座質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-Pvs25-TM轉化含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DH10Bac感受態細胞，進行同源重組，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環素、X-gal和IPTG的LB培養平板上進行藍白斑篩選，避光培養40-48h后挑取白斑，白斑繼續培養24-48h后抽提重組桿狀病毒基因組DNA進行PCR鑒定；

（3）取步驟（2）鑒定正確的重組桿狀病毒基因組DNA通過脂質體介導法轉染家蠶BmN細胞，發病后獲得一代病毒懸液，提取病毒基因組再次進行PCR鑒定，鑒定正確的即為表面展示間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25的重組桿狀病毒BmPvs25。

7.權利要求3-5任一權利要求所述的重組桿狀病毒BmPvs25所表達的融合蛋白SP-Pvs25-TM，其特征在于：由間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25的N端接gp64分泌性信號肽（SP）、C端接gp64跨膜結構域（TM）構成，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：8所示。

8.權利要求3-5任一權利要求所述的重組桿狀病毒BmPvs25在間日瘧傳播阻斷疫苗制備中的應用。

9.權利要求7所述的融合蛋白SP-Pvs25-TM在間日瘧傳播阻斷疫苗制備中的應用。