[發明專利]利用DArT標記技術分析三疣梭子蟹遺傳多樣性的方法

有效

• 申請號: 201310705075.5
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN103710444A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 陳炯;史雨紅
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B50/06
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術領域

本發明涉及一種分析三疣梭子蟹遺傳多樣性的方法，尤其是涉及一種利用DArT標記技術分析三疣梭子蟹遺傳多樣性的方法。

背景技術

三疣梭子蟹(Portunus?trituberculatus)隸屬甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹屬(portunus)，是一種重要的大型海產經濟蟹類，廣泛分布于中國、日本、朝鮮及馬來西亞群島等海域，它具有肉質好、生長快、產量高等優點，經濟價值高，養殖利潤豐厚，隨著海水養殖的快速發展，三疣梭子蟹養殖已成為各沿海地區的主導養殖品種。

目前，三疣梭子蟹養殖業的蟹苗主要還是依靠野生資源，由于環境惡化、病害和過度捕撈導致野生資源急劇下降，嚴重限制了養殖業的發展，因此迫切需要對野生資源進行保護，了解三疣梭子蟹的野生種群遺傳結構，為開展優良、抗逆品種的選育提供科學依據，保持我國三疣梭子蟹養殖業的持續健康發展。據報道，同工酶、16S?rRNA、線粒體DNA、COI、CR、ITS1基因片段序列分析、隨機擴增多態性?DNA?(RAPD)、擴增片段長度多態性(AFLP)、微衛星標記(SSR)?等技術均以廣泛應用于研究三疣梭子蟹種群內和種群間、或與其他相近物種之間的遺傳關系。但上述技術存在檢測位點少、篩選周期長、自動化程度低，需已知基因組序列信息等缺點。

多樣性芯片技術(Diversity?Arrays?Technology，DArT)是一種新遺傳標記技術，綜合了基因芯片、AFLP、PCR、分子克隆等技術，不需已知基因組序列，因此十分適合研究非模式生物。同時，它具有高通量和低成本的顯著特點，較好地克服了以往跑電泳凝膠為主的標記技術產量低、成本高、耗時長、自動化程度低以及依賴核酸序列信息等缺點，是一種比較理想的遺傳標記技術，已成功應用于水稻、大麥和木薯等多種農作物和細菌的遺傳多樣性和種質鑒定研究。但是，目前國內外還沒有公開任何關于利用DArT標記技術分析三疣梭子蟹地理種群遺傳多樣性的方法的相關研究報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種高效、穩定、準確的利用DArT標記技術分析三疣梭子蟹遺傳多樣性的方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種利用DArT標記技術分析三疣梭子蟹遺傳多樣性的方法，包括以下步驟：

（1）三疣梭子蟹基因組代表性DNA片段文庫構建

提取不同地理種群三疣梭子蟹的DNA并等量混合，將混合基因DNA采用限制性內切酶消化后，進行接頭連接，連接產物作為模板進行后續PCR擴增，擴增產物純化后，克隆至載體pMD19-T，轉化大腸桿菌TOP10F’并涂布于含氨芐青霉素和X-gal的LB培養基上得到基因組代表性DNA文庫；

（2）基因組代表性DNA芯片點制

從基因組代表性DNA文庫中隨機挑選單菌落，采用質粒載體上的通用引物M13F-47和M13R-48對插入的DNA片段進行PCR擴增，擴增產物用異丙醇沉淀后，采用微陣列芯片點樣儀進行芯片點制，同時在芯片上設置一系列陽性和陰性對照；

（3）芯片雜交和清洗

提取不同地理種群三疣梭子蟹的DNA，分別采用限制性內切酶消化后，進行接頭連接，連接產物作為模板進行后續PCR擴增，擴增產物用異丙醇沉淀后，加入試劑盒中進行Cy3熒光標記，于37℃孵育10min后，加入dNTPs?0.4μL，再于37℃孵育30min，加入0.1μL?pH?8.0的EDTA終止反應，得到Cy3標記反應產物；其中酶切、接頭連接及PCR擴增的具體過程同上述步驟（1）；???

采用pMD19-T載體多克隆位點片段為參考DNA并進行Cy5熒光標記，得到Cy5標記反應產物；將Cy3標記反應產物和Cy5標記反應產物各5.5μL等量混合后，再加入1μL的濃度為10g/L的鮭魚精DNA和50μL?ExpressHyb?雜交液混合后，96℃變性3?min，冰浴驟冷1min，得到Cy3-Cy5標記產物；

將步驟（2）得到的基因組代表性DNA芯片在紫外交聯儀中250毫交交聯備用，然后將基因組代表性DNA芯片與Cy3-Cy5標記產物在晶芯^?雜交儀中進行雜交反應，于65℃孵育過夜，雜交后先用0.3×SSC，0.1%?SDS各清洗一次，再用0.06×SSC清洗兩次，離心甩干；

（4）數據采集和分析