[發明專利]利用DArT標記技術分析三疣梭子蟹遺傳多樣性的方法

有效

• 申請號: 201310705075.5
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN103710444A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 陳炯;史雨紅
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B50/06
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.一種利用DArT標記技術分析三疣梭子蟹遺傳多樣性的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）三疣梭子蟹基因組代表性DNA片段文庫構建

提取不同地理種群三疣梭子蟹的DNA并等量混合，將混合基因DNA采用限制性內切酶消化后，進行接頭連接，連接產物作為模板進行后續PCR擴增，擴增產物純化后，克隆至載體pMD19-T，轉化大腸桿菌TOP10F’并涂布于含氨芐青霉素和X-gal的LB培養基上得到基因組代表性DNA文庫；

（2）基因組代表性DNA芯片點制

從基因組代表性DNA文庫中隨機挑選單菌落，采用質粒載體上的通用引物M13F-47和M13R-48對插入的DNA片段進行PCR擴增，擴增產物用異丙醇沉淀后，采用微陣列芯片點樣儀進行芯片點制，同時在芯片上設置一系列陽性和陰性對照；

（3）芯片雜交和清洗

提取不同地理種群三疣梭子蟹的DNA，分別采用限制性內切酶消化后，進行接頭連接，連接產物作為模板進行后續PCR擴增，擴增產物用異丙醇沉淀后，加入試劑盒中進行Cy3熒光標記，于37℃孵育10min后，加入dNTPs?0.4μL，再于37℃孵育30min，加入0.1μL?pH?8.0的EDTA終止反應，得到Cy3標記反應產物；其中酶切、接頭連接及PCR擴增的具體過程同上述步驟（1）；???

采用pMD19-T載體多克隆位點片段為參考DNA并進行Cy5熒光標記，得到Cy5標記反應產物；將Cy3標記反應產物和Cy5標記反應產物各5.5μL等量混合后，再加入1μL的濃度為10g/L的鮭魚精DNA和50μL?ExpressHyb?雜交液混合后，96℃變性3?min，冰浴驟冷1min，得到Cy3-Cy5標記產物；

將步驟（2）得到的基因組代表性DNA芯片在紫外交聯儀中250毫交交聯備用，然后將基因組代表性DNA芯片與Cy3-Cy5標記產物在晶芯^?雜交儀中進行雜交反應，于65℃孵育過夜，雜交后先用0.3×SSC，0.1%?SDS各清洗一次，再用0.06×SSC清洗兩次，離心甩干；

（4）數據采集和分析

雜交后采用芯片掃描儀進行掃描，并用LuxScan3.0?軟件提取數據，若對應的參考DNA雜交熒光強度較弱，則屬于壞點，棄之；質量符合條件的探針，轉換成0或1標記矩陣，計算獲得多態性效率、多態信息含量和遺傳分型圖譜。

2.根據權利要求1所述的利用DArT標記技術分析三疣梭子蟹遺傳多樣性的方法，其特征在于步驟（1）混合基因DNA采用限制性內切酶消化的具體步驟如下：采用Pst?I?和TaqI雙酶切體系進行酶切，Pst?I和TaqI雙酶切體系包括混合基因DNA?5μl，15U/μl的PstI內切酶?1μl，10U/μl?TaqI內切酶?1μl，10×TaqI?Basal?buffer?2μl，加水至20μl，于37℃酶切2h。

3.根據權利要求1所述的利用DArT標記技術分析三疣梭子蟹遺傳多樣性的方法，其特征在于步驟（1）接頭連接的具體步驟如下：

a.?接頭連接反應體系配置：50μM?的DArT-PstI接頭引物1?1.28?μL，50μM的DArT-PstI接頭引物2?1.28?μL，0.5M?NaCl?2.00μL，加水至反應總體積為20μL，然后加熱到95℃再降到室溫；其中DArT-PstI接頭引物1序列為5’-CACGATGGATC?CAGTGCA-3’，?DArT-PstI接頭引物2序列為5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’；

b.取9?uL酶切后的產物與1?uL上述接頭連接反應體系混合，然后加入10μL?T4?DNA連接酶，于16℃，連接反應2h。