[發明專利]一種蛋白質產品重復利用的方法

在審

• 申請號: 201310705054.3
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN104725464A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發明（設計）人: 鄭春楊;王永宏;馮建敏;張琳;王琳
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C07K1/113
• 分類號: C07K1/113;C07K1/18
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種蛋白質產品重復利用的方法，包括將蛋白質PEG修飾，待活性降低，產品超過有效期后，將其徹底做變性處理，并重折疊的步驟。其優點在于，可以提高蛋白質產品的重復利用次數，降低成本。而且，在重折疊步驟中，可以有效提高復性蛋白的濃度和成功率。

技術背景

與化學產品相比，蛋白質產品都面臨結構不穩定、隨著時間延長活性快速降低的問題，從而導致蛋白質產品有效期短、價格偏高。

這種不穩定性有的來自物理因素，有的來自化學因素。最常見的不穩定性就是在一定的條件下，蛋白質的二級、三級和四級結構可能會發生變化，這會導致蛋白質聚集。蛋白質聚集會導致活性的損失或者降低，減少溶解性。在很多情況下，蛋白質的聚集是由于部分變性的蛋白質鏈的分子間交聯。有研究表明聚合可能發生于蛋白質特定過渡態構象，而不是非特異性的結合。聚集過程大體分為三個步驟：引發，傳遞和終止。蛋白質聚集可以在熱力學上減少溶劑和蛋白質暴露的疏水殘基之間的不利作用。疏水相互作用對與蛋白質折疊和聚集都是主要的驅動力。蛋白質的折疊和聚集都代表了暴露于蛋白表面和埋藏蛋白內部的疏水殘基的一種平衡。這種平衡非常的精細，改變蛋白質中的一個氨基酸可能會完全改變其聚集行為。

蛋白質的聚集可以有很多的物理因素誘導，比如溫度，離子強度，渦流，表面或界面吸附等等。這些因素可以增加蛋白的疏水表面，會導致蛋白質的聚集。例如，人重組角化細胞生長因子(rhKGF)在升溫過程中會緩慢變性，會導致蛋白聚集進而沉降。濃度為0.5mg/ml的豬重組生長激素在63℃時會發生沉淀。劇烈攪拌人重組生長因子溶液(0.5mg/ml，pH7.4)一分鐘后有67％的蛋白質聚集為不可溶蛋白。

化學降解和修飾會暴露出蛋白質的疏水表面，也會導致蛋白質的聚集。蛋白質顆粒直接的形成化學鍵合的聚合體，如胰島素；也可以發生化學變化后聚集，比如人恥骨松弛激素在His和Met被氧化以后發生聚集。物理和化學聚合也可能同時發生。例如冷凍干燥的β-半乳糖酶在儲藏過程中可以發生二硫鍵的鍵合而聚集，同時由于非化學鍵合的相互作用也可形成可溶性的聚集體。

蛋白質的聚集可以由單一的分子開始(單一分子或分子內過程)，也可以由多個分子開始。單一分子過程包括β-消除和鏈間二硫鍵的錯位，比如水溶液中的白細胞介素-1受體拮抗劑。多分子聚集過程包括牛血清白蛋白的巰基二硫鍵交換，胰島素的巰基催化的二硫鍵交換。形成共價聚合的例子還有核糖核酸酶A，非共價聚合的例子有破傷風類毒素。如果隨著蛋白濃度的增加，聚集體所占的比例在增加，則此過程可能涉及多分子參與。

綜上，蛋白質產品本身會受到生產和儲存環節不同物理、化學因素的影響逐漸失去活性。

針對以上問題，聚乙二醇(PEG)修飾技術應運而生，通過將高分子PEG鏈，與蛋白質結合，從而屏蔽和削弱部分物理和化學作用的影響，從而起到保護蛋白質、延長產品有效期的作用。PEG修飾技術已經發展成熟，在生物醫藥方面已經多有嘗試并且有產品上市，比如先靈葆雅公司的PEG修飾干擾素。然而對于日化和工業等方面，由于苛刻的工況條件和更高的成本降低需求，需要進一步探索延長有效期或者重復利用的方法。

本發明則是從PEG修飾蛋白和蛋白質重折疊過程的角度，開發一種新的方法，包括將蛋白質PEG修飾，待活性降低，產品超過有效期后，將其徹底做變性處理，并重折疊的步驟。其優點在于，可以提高蛋白質產品的重復利用次數，降低成本。而且，在重折疊步驟中，可以有效提高復性蛋白的濃度和成功率。具體依據如下：

聚乙二醇(polyethylene?glycol，PEG)是由很多重復的氧乙烯基(-CH₂-CH₂-O-)結構單元組成的線形或帶支鏈的中性惰性大分子聚合物，其CAS登記號為25322-68-3，化學結構如下所示。

HO-(CH₂-CH₂-O)_n-1-CH₂-CH₂-OH