[發明專利]表達人血清白蛋白的靶向載體及其構建方法

有效

• 申請號: 201310704929.8
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN104726490B
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 王向東;高鵬;魏光偉;李相芝
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027;C07K14/765
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司37221
• 代理人: 彭成

技術領域

本發明涉及一種可利用轉基因雞的雞蛋生產人血清白蛋白的靶向載體，涉及自主設計、克隆多個適合人血清白蛋白在雞蛋蛋清中表達的調控反應元件以及能夠使人血清白蛋白重組于雞卵清白蛋白序列的元件，并進行基因工程克隆，構成人血清白蛋白在雞輸卵管組織特異性表達的基因打靶載體ROSA26-shALBl，此載體的構建是后期獲得能夠在蛋清中表達人血清白蛋白的轉基因雞的核心技術，屬于基因工程技術領域。

背景技術

人血清白蛋白是由585個氨基酸組成的單鏈蛋白質，分子量為67kDa，白蛋白是血漿中含量最高的蛋白質。白蛋白具有維持血液滲透壓、抗休克、運輸與解毒、促進肝細胞修復與再生等作用，是國際上使用最多的血液制品。臨床上主要用于燒傷、失血性休克、水腫、低蛋白血癥等的治療。

醫用血清白蛋白的傳統獲得方法是從健康人血漿中提取，但由于血漿制品具有污染人原病毒的可能以及目前血液源的枯竭，使該方法受到很大限制，難以得到足夠的血液制品。目前我們國家每年需要白蛋白120噸，而通過獻血能制備的白蛋白僅為所需求量的1/3，因此，白蛋白供應嚴重緊缺。

目前重組生物制藥中普遍采用酵母、大腸桿菌發酵制備，但此方法存在諸多的缺點，例如：微生物與人體環境差異大，表達產品生物活性低、摻雜的微生物毒素難以徹底去除，生產工藝復雜，很難形成規模化生產。因此，迄今為止，還沒有相關產品上市。最近也有國際公司利用轉基因技術制備轉基因動物來制備人重組蛋白產品，與傳統的微生物表達系統相比，動物生物反應器具有以下特點：1）生產的蛋白質生物活性高，能夠對重組蛋白質進行多種翻譯后加工，非常接近天然產品；2）表達量大、成本低；3）產品易提純、質量高，避免了其他生產方式的化學及生物毒素的污染，安全可靠；4）易產業化：轉移的目的基因能夠遺傳，使某一群體都具有同一特性，可通過動物繁殖擴群，進行規模化生產。但人類基因是隨機插入動物的基因組內，雖然與微生物發酵相比有很大優勢，但也存在著很多不可控的因素和缺陷，有很大的改進空間：1）目的基因的整合與表達的效率較低；2）有可能引起宿主細胞基因突變；3）轉基因模型與預期結果不符，或表達個體的機能紊亂；4）動物本身的相應的蛋白仍在表達，純化中很難去掉，容易引起人類的過敏反應。因此，轉基因動物還不是理想的生物反應器。

綜上，尋求一種合適的表達人血清白蛋白的方法是亟需解決的問題。

發明內容

針對上述現有技術，本發明提供了一種表達人血清白蛋白的靶向載體及其構建方法。本發明構建的載體能夠使人血清白蛋白整合在雞基因組中并以雞的卵清白蛋白為標靶的進行基因敲入，將該載體轉化入雞的生殖細胞、得到轉基因雞后，其產生的卵（雞蛋）中將特異性地表達人血清白蛋白。本發明通過基因重組技術對雞進行遺傳修飾，改變其基因組的組成，培育出能夠在雞卵（雞蛋）中表達人類血清白蛋白的轉基因雞，并且確保這種遺傳修飾的改變能夠被子代繼承，長久的傳遞下去。

本發明是通過以下技術方案實現的：

為滿足上述的實驗設計，本發明將適合人血清白蛋白在雞蛋蛋清中表達的調控反應元件以及人血清白蛋白的基因重組于雞卵清白蛋白序列的元件，并進行基因工程克隆，構成人血清白蛋白在雞輸卵管組織特異性表達的基因打靶載體ROSA26-shALBl，具體技術方案如下：

一種表達人血清白蛋白的靶向載體，構建圖譜如圖1所示，結構為：包含有人血清白蛋白基因（序列如SEQ ID NO.2所示，所表達的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示），以及進行同源重組的雞源的兩個同源序列：5’同源臂、3’同源臂，5’同源臂為1.7kb（SEQ ID NO.3所示），3’同源臂為5.2kb（SEQ ID NO.4所示），人血清白蛋白基因的5’端連接有kozak序列，kozak序列為GCCACC，同時還包含有進行藥物篩選的neo基因和報告基因EGFP。

所述表達人血清白蛋白的靶向載體的構建方法，該方法的關鍵在于構建一種可以準確的將人血清白蛋白插入到PGC細胞的基因組中并能夠成功表達人血清白蛋白的基因定點插入的載體，應用這種載體通過顯微注射技術將完成遺傳物質修飾的PGC細胞轉入胚胎中，能夠獲得轉基因雞。該轉基因雞的輸卵管細胞以及生殖細胞可由被修飾的PGC細胞發育而成，在形成卵的過程中表達產生人血清白蛋白，并且在其后代中穩定的傳遞轉基因修飾，產生子代轉基因雞。構建方法具體如下：